Implementering af Long-read-sekventering til diagnostik af sjældne sygdomme. (LongEpi)

Som en opfølger på den tredje nationale plan for sjældne sygdomme (PNMR3) er hovedmålene for PNMR4 at reducere diagnostisk usikkerhed og blindgyder samt at styrke translationel forskning for at fremme diagnose og udvikling af nye behandlinger inden for sjældne sygdomme.

I denne forbindelse organiserer den franske genommedicinplan 2025 (PFMG2025) implementeringen af helgenomsekventering (WGS) til diagnostiske formål.

Denne teknologiske milepæl, som dækker regioner uden for kodende regioner, har for nylig muliggjort identifikation af variationer i RNU4-2-genet som en væsentlig årsag til intellektuel udviklingsforstyrrelse (IDD), der udgør cirka 0,4% af tilfældene. RNU4-2 er et gen, der koder for en lille nukleær RNA (snRNA), som ikke oversættes til protein, og hvis variationer ikke er tilgængelige for ekstomsekventeringsteknikker.

Baseret på nuværende viden er disse teknikker dog baseret på kortlæsningsteknologi og kan diagnosticere op til 50% af patienter. Derfor er det nødvendigt at udvikle nye teknikker til at påvise variationer, der ikke identificeres af disse teknikker.

I denne sammenhæng gør udviklingen af tredjegenerationssekventering, især ved brug af Nanopore-teknologi, det nu muligt at kombinere genomiske og post-genomiske tilgange gennem langlæsnings-helgenomsekventering kombineret med detektion af methylerede cytosiner på naturligt DNA.

Denne nye tilgang muliggør således samtidig detektion af punkt- eller strukturelle genomiske varianter, methyleringsabnormiteter og haplotyprekonstruktion. Adskillige undersøgelser har vist, at denne strategi forbedrer diagnosticeringsraten for sjældne sygdomme og kunne blive et førstevalgs genetisk test.

DNA-methylering er en epigenetisk modifikation, der ikke forårsager ændringer i den genomiske sekvens, men regulerer transkription (RNA-syntese) af gener og dermed deres udtryk. Methyleringsundersøgelser udføres enten for at etablere en episignatur eller for at søge efter methyleringsabnormiteter. En episignatur er resultatet af en variation i et gen, der er kendt for at regulere methyleringsmærker.

Methyleringsabnormiteter er allerede kendte og efterspurgte i målrettede analyser for visse sygdomme såsom Prader-Willi/Angelman-syndromer og Beckwith-Wiedemann/Silver-Russell-syndromer. Bidraget fra methyleringsanalyse til diagnosticering af andre sygdomme er for nylig blevet påvist. For eksempel afslørede promotor-methyleringsanalyse i methylmalonaciduri og homocystinuri type cblC associeret med det autosomalt recessive gen MMACHC hypermethylering forbundet med tilstedeværelsen af en intronisk variant af PRDX1-genet. Denne introniske variant fører til syntese af et aberrant antisense-RNA, der overlapper promotoren for MMACHC-genet, hvilket forårsager dets hypermethylering. I 2024 førte kombineret helgenom- og methyleringsanalyse hos patienter med porokeratose til opdagelsen af FDFT1-genet. Generelt har undersøgelsen af methyleringsprofiler vist sin værdi i at reducere diagnostisk usikkerhed hos patienter med sjældne sygdomme, der ikke er blevet diagnosticeret efter genomanalyse.

Søgningen efter methyleringsabnormiteter (eller epimutation) på pangenomisk niveau i forbindelse med molekylær diagnostik af sjældne sygdomme forbliver i høj grad utilgængelig og dårligt beskrevet i litteraturen. De rutinemæssigt anvendte teknikker til deres detektion er oftest baseret på bisulfitbehandling og PCR-forstærkning. Ulemperne ved bisulfitbehandling er, at det nedbryder DNA, hvilket forhindrer langlæsningsapplikationer, at det ikke skelner mellem 5mC- og 5hmC-methylering, og at manglende behandling af umethylerede cytosiner kan føre til falske positive. Derudover kræver fasebestemmelse med en genomisk variant identificeret i kortlæsninger komplementære teknikker såsom SNP-arrays.

Denne tilgang fremstår således som et væsentligt teknologisk fremskridt i kampen mod diagnostisk usikkerhed ved sjældne sygdomme og indgår i bevægelsen mod præcisionsmedicin for patienter.

Som en del af vores Referencecenter for Udviklingsanomalier og Malformationssyndromer i Sydvest Occitanie Réunion (CRMR ADSOOR) på Bordeaux Universitetshospital har vi udviklet klinisk og molekylær ekspertise, især inden for udviklingsanomalier med intellektuelle udviklingsforstyrrelser (især kromatinopatier og Rubinstein Taybi-syndrom og albinisme).

I 2024 blev 2.300 konsultationer gennemført på CRMR. Derudover blev 243 og 228 genom- eller ekstomanalyser fortolket i vores molekylærbiologiske laboratorium for henholdsvis albinisme og intellektuel udviklingsforstyrrelse og malformationssyndrom.

Vores ekspertise inden for disse to områder udgør således det bedste udgangspunkt for udviklingen af dette pilotprojekt ved brug af denne innovative tilgang på Bordeaux Universitetshospital.