SEXI: Ischias-Expression und Identifizierung unterschiedlicher Proteine ​​in traumatisierten versus nichttraumatisierten Nerven (SEXI)

Probanden, die für eine endgültige Amputationsrevision und Schließung(en) vorgesehen sind, werden zur Teilnahme an der Studie angesprochen. Am Tag der geplanten Amputationsrevision des Studienteilnehmers wird sich das Forschungspersonal mit dem chirurgischen Personal in Verbindung setzen, um die Nervenprobenentnahme zu koordinieren. Wenn ein Patient oberhalb des Knies amputiert werden soll, wird eine Ischiasnerv-Probe entnommen, wenn ein Patient unterhalb des Knies oder durch das Knie amputiert werden soll, wird eine Tibia-Nerv-Probe entnommen (der Hauptbestandteil des Ischiasnervs). nach der Aufteilung in die Schienbein- und Peronaeusnerven in der Kniekehle). Der Chirurg platziert eine Naht am proximalen Ende der Probe, um das nicht traumatisierte Ende des Nervs anzuzeigen, sowie eine Schätzung der Längslage des entnommenen Nervs (d. h. 10 cm distal der Kniegelenkslinie, 15 cm proximal des Knies auf Höhe des Kniegelenks). Jede Probe wird auf die gleiche Weise ausgeschnitten – mit einem Skalpell. Sobald das Gewebe vom Chirurgen entfernt wurde, wird es in ein Plastikreagenzglas gegeben, das mit der Studienidentifikationsnummer des Probanden gekennzeichnet ist (mit dem Suffix „A“ oder „B“, wenn zwei Proben von diesem Probanden entnommen werden). einem wissenschaftlichen Mitarbeiter übergeben und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die gefrorene Probe wird dann an das Labor des Department of Research Programs geliefert, wo sie vor der Analyse bei -80 °C gelagert wird. Die promixalen, mittleren und distalen Proben werden im DRP-Labor entnommen und die verbleibenden Nervensegmente werden für zukünftige Analysen in den -80-Gefrierschrank zurückgelegt. Die Proben werden dann zur Verarbeitung und Analyse über einen sicheren Luftpostboten an die Duke University geschickt. Die Aufgabe der Probenverarbeitung wird unmittelbar vor der massenspektroskopischen Analyse von Kollegen der Duke University durchgeführt. Zu den Laboraufgaben des Mitarbeiters Dr. Moseley gehören sowohl die Proteinextraktion als auch der Assay. Die Anzahl der Extraktionen pro Probe variiert je nach Länge zwischen 2 und etwa 50. Zu den Laboraufgaben des Mitarbeiters Dr. Van de ven gehören die Probenhandhabung, die pathologische Untersuchung, das Entfernen dünner Schnitte für die histologische Untersuchung und die Segmenthomogenisierung für die RNA-, DNA- und Proteinextraktion.

Einzelne Segmente werden auf Eis aufgetaut und unmittelbar nach dem Auftauen homogenisiert. Homogenisierungsmethoden werden optimiert, um den höchsten Gehalt an gelöstem Protein zu erzeugen. Zu den zu erprobenden Methoden gehören Beschallung, mechanisches Aufbrechen durch einen Labormixer, mechanisches Aufbrechen durch manuelles Zerkleinern, gefolgt von einem Potter-Gerät, und Gefrier-Auftauen.

Zu testende Puffer- und Lösungsmittelsystemvariablen umfassen Salzkonzentration, pH-Wert und Puffertyp, chaotrope Konzentration (Harnstoff und Thioharnstoff), Anwesenheit von organischen Co-Lösungsmitteln wie DMSO und die Anwesenheit von nichtionischem Detergens. Die gesamte Homogenisierung wird zwischen 0 und 4°C und in Gegenwart von Protease-Inhibitoren durchgeführt.

Für die Proteomikanalyse wird Hochleistungsflüssigkeitschromatographie/Elektrospray-Massenspektrometrie als ergänzender Weg zur Entdeckung von Unterschieden in der Proteinexpression zwischen gesundem und traumatisiertem Gewebe eingesetzt. Nach der Festphasenextraktion von löslichen und solubilisierten Proteinen optimieren wir die Bedingungen für die Trennung von Proteinpeaks, die durch UV-Absorption und/oder Gesamtionenstrom erkannt werden, und können mehr als einen Satz von Bedingungen anwenden, um sich auf verschiedene Sätze extrahierter Proteine ​​zu konzentrieren. Wir werden C-18-Umkehrphasensäulen mit hoher Porosität verwenden, um zytosolische Proteine ​​zu trennen, und C-4 für Membranproteine. Es werden Standardverfahren zur Ionisierung, Fragmentierung und Detektion verwendet, die mit dem Shimadzu LCMS-IT-TOF-Massenspektrometer des Research Operations Service (ROS) übereinstimmen.

Für die RNA-Analyse wird die extrahierte RNA zum Core des Duke Center for Genomic and Computational Biology Genomic Technologies gebracht. Dort wird die RNA-Qualität mit einem Agilent 2100bioanalyzer bestimmt, gefolgt von einer Affymetrix GeneChip-Analyse. David Corcoran, der Biostatistiker, der am Duke Center for Genomic and Computational Biology arbeitet, wird die Datenanalyse durchführen.

In dieser Studie werden keine Änderungen am Behandlungsstandard vorgenommen. Die Ischiasnervenproben würden andernfalls als menschliches Gewebe entsorgt werden; Es gibt keine weiteren laufenden Untersuchungen mit diesen Proben.

Nach der Analyse des Ischiasnervs werden wir Daten – demografische Informationen, Informationen zu Verletzungen und Schmerzbehandlungen sowie präoperative Schmerzwerte – aus den Krankenakten der Probanden sammeln, um sekundäre Ergebnisvariablen zu bestimmen. (Siehe Anhang B – Fallberichtsformulare)