Definition des Status der Nischen menschlicher Lungenstammzellen ex vivo in Gewebebiopsien, die bei Patienten mit Emphysem und interstitieller Fibrose durchgeführt wurden

Wissenschaftlicher Hintergrund

Degenerative Lungenerkrankungen sind das Ergebnis entzündlicher Ereignisse, die mit der Zerstörung der normalen Lungenarchitektur enden. Es gibt zwei Hauptmuster:

1. Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. Bis 2020 wird sie voraussichtlich die dritte Todesursache nach Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebs sein. Emphysem ist die destruktive Form von COPD, da das alveoläre Gewebe verschwindet. Dieses anatomische Muster ist nicht immer homogen und die Funktionsbeeinträchtigung ist nicht mit dem Ausmaß der Gewebezerstörung verbunden. Eine therapeutische Beseitigung des zerstörten Gewebes kann durch eine Operation oder durch verschiedene Blockierungstechniken (Lung Volume Reduction) erreicht werden.
2. Lungenfibrose (PF) ist durch eine abnormale Reparatur des respiratorischen Epithels gekennzeichnet. Verschiedene Krankheiten können zu PF führen, wie Infektionen, Autoimmunerkrankungen (Bindegewebserkrankungen), Sarkoidose, Hypersensitivitätspneumonitis, Pneumokoniose, Histiozytose X, Lymphangioleiomyomatose LAM usw. In vielen Situationen kann eine Ursache-Wirkungs-Beziehung nicht identifiziert werden und die Krankheit ist idiopathische IPF.

In den letzten Jahren wurden zellbasierte Therapien mit Vorläuferzellen und verschiedenen Scaffolds in verschiedenen medizinischen Bereichen verfügbar. Die regenerative Lungenmedizin scheint bei diesen Erkrankungen im Endstadium eine Alternative zur Transplantation zu sein.

Die sehr komplexe zelluläre Zusammensetzung der Lunge, die mehr als 40 verschiedene Zelltypen umfasst, macht dieses Ziel jedoch zu einer Herausforderung. Die epitheliale Auskleidung der Atemwege, bestehend aus leitenden und respiratorischen Teilen, variiert entlang ihrer proximo-distalen Achse. Die leitenden Atemwege von der Trachea zu den Bronchiolen der menschlichen Lunge bestehen aus pseudostratifiziertem Epithel, das zu gleichen Anteilen aus Basalzellen, sekretorischen Zellen und Flimmerhärchen sowie einigen neuroendokrinen Zellen besteht. Die kleinsten Bronchiolen, bekannt als terminale und respiratorische Bronchiolen, sind mit einem einfachen säulen- oder quaderförmigen Epithel ausgekleidet, das sekretorische und bewimperte Zellen mit weniger Basalzellen enthält. Die Epithelien dieser leitenden Atemwege bilden eine dichte Barriere gegen die Außenwelt und sind auf den Prozess der mukoziliären Clearance spezialisiert. Die Alveolen sind mit alveolären Epithelzellen vom Typ 1 und 2 ausgekleidet, die im Folgenden AT1 bzw. AT2 genannt werden. Diese Zellen sind auch auf Barrierefunktionen spezialisiert, und die extrem dünnen AEC1 teilen sich eine Basalmembran mit dem umgebenden Netzwerk von Lungenkapillaren, um die Diffusion von Gasen zwischen der Atmosphäre und dem Kreislauf zu erleichtern.

Diese allgemeine Verteilung von Epithelzelltypen ist zwischen Menschen und Modellorganismen wie Nagetieren konserviert. Es gibt jedoch bemerkenswerte Unterschiede. Zum Beispiel tritt der Übergang von einem pseudostratifizierten zu einem säulenförmigen Epithel bei Nagetieren weiter proximal auf, sodass nur die Trachea und die Hauptbronchien mit einem pseudostratifizierten Epithel ausgekleidet sind. Nahezu alle intralobären Atemwege bei Mäusen sind mit einem einfachen Säulen- oder Quaderepithel mit wenigen Basalzellen ausgekleidet. Bei Mäusen ist der abrupte Übergang von einem leitenden Atemweg zu den Alveolen als Broncho-Alveolargang-Verbindung bekannt. Beim Menschen entstehen aus terminalen Bronchiolen respiratorische Bronchiolen, von denen viele Alveolargänge letztendlich in Alveolen enden. In Anbetracht der wesentlichen Rolle des Epithelkompartiments in der Lunge wurden große Anstrengungen unternommen, um epitheliale Stamm- und Vorläuferzellen zu identifizieren, die für regenerative und reparative Funktionen verantwortlich sind.

Epitheliale Vorläufer leben in einzigartigen Mikroumgebungen oder Nischen, repräsentiert durch vaskuläre und mesenchymale Zellen, die reich innerviert sind. Diese Architektur ähnelt stark HSM-Nischen.

Bei Mäusen wurden beträchtliche Fortschritte bei der Identifizierung der Signale erzielt, die die Selbsterneuerung und Differenzierung von Lungenepithel-Stammzellen regulieren. Dazu gehören Notch, Hippo/Yap, ROS/Nrf2, EGF, FGF, c-myb und Zytokine einschließlich IL-4, -13 und -6. Benachbarte Epithelzellen, Stromazellen (einschließlich mesenchymaler Zellen, Fibroblasten, glatter Muskelzellen und Endothelium) und Immunzellen stellen alle mögliche Quellen für diese Faktoren dar. In der Trachea und Lunge der erwachsenen Maus wurden im Steady State unterschiedliche Stammzellnischen definiert, und es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass Stammzellnischen unter verschiedenen pathologischen Bedingungen beeinträchtigt und verändert werden.

Über Stammzellen und Stammzellnischen in der menschlichen Lunge Erwachsener und die Signale, die die Aufrechterhaltung der Homöostase des Lungengewebes bei Gesundheit und Krankheit regulieren, ist sehr wenig bekannt.

Kürzlich hat die Reisner-Gruppe am Weizmann-Institut gezeigt, dass die Räumung der Lungenstammzellnischen eine Voraussetzung für eine erfolgreiche Transplantation von Maus- oder menschlichen Lungenvorläufern ist (Nature Medicine 2015). Dazu nutzten sie eine anfängliche Lungenverletzung mit Naphthalin, die eine sofortige Stimulation körpereigener Vorläufer auslöste. Somit konnten die sich teilenden Vorläuferzellen innerhalb von 48 Stunden durch eine 6-Gy-Ganzkörperbestrahlung effektiv abgetragen werden, was eine effektive Transplantation von Spender-Lungenvorläuferzellen ermöglichte (Abb. 1).

Abb. 1: Transplantation und funktionelle Reparatur verletzter Lungen durch embryonale Lungenzellen der Maus. Nach Lungenverletzung mit NA und Konditionierung mit 6Gy TBI wurden erwachsenen C57BL/6-Mäusen syngene embryonale Lungenzellen im E16-Stadium von GFP+-Spendern transplantiert. (a,b) Repräsentative Zwei-Photonen-Mikroskopie-Bilder mit erweitertem Fokus der Lungen transplantierter Mäuse 6 Wochen nach der Transplantation, die die gesamte Scantiefe von oben nach unten der chimären Lunge zeigen, ohne (a: Z-Stapel 88 μm) und mit (b ) Co-Färbung von Blutgefäßen mit Quantum Dots (rot) (Balken=90μm). (c) Zwei-Photonen-Bild mit erweitertem Fokus, das die gesamte Scantiefe von oben nach unten der chimären Lunge (Z-Stapel 96 μm) 16 Wochen nach der Transplantation zeigt. (d) Zwei-Photonen-Mikroskopie einer nicht-transplantierten C57BL-Mauslunge mit Hintergrund (Balken = 90 μm). (e,f,g) Repräsentative Bilder von chimären Lungen, die mit Anti-GFP (grün) und Anti-AQP-5 (rot) gefärbt sind, was auf den Einbau von Spender-abgeleiteten Typ-I-Alveozyten in die Gasaustauschoberfläche hinweist. (h, i, j) Chimäre Lunge, gefärbt mit Anti-GFP (grün), Anti-Sp-C-Antikörpern (blau), was vom Spender stammendes Surfactant zeigt, das Alveozyten vom Typ II produziert (Balken = 20 μm). Alle oben gezeigten Einzelbilder sind repräsentativ für n = 10 Mäuse, die aus 3 unabhängigen Experimenten gepoolt wurden. (m,n) Lungenfunktionsmessungen 6 Wochen nach Transplantation. (k, l) Färbung der chimären Lunge für CFTR (rot) und (GFP), die CFTR-positive Spenderzellen zeigt. (m) Lungengrundlinien-Compliance. Vergleich von intakten Kontrollmäusen mit Mäusen mit Lungenverletzung (Student's t-Test, P < 0,001) und von Mäusen mit Lungenverletzung mit nach Verletzung transplantierten Mäusen (Student's t-Test, P = 0,008). (n) Gewebedämpfung. Vergleich von Kontrollmäusen mit Mäusen mit Lungenverletzung (Student's t-Test, P = 0,015) und von Mäusen mit Lungenverletzung mit nach Verletzung transplantierten Mäusen (Student's t-Test, P = 0,021). Die Werte sind Mittelwerte ± SEM von 10–15 (n = 15 Kontroll-, n = 10 verletzte und n = 10 behandelte) Mäuse in jeder Gruppe, gepoolt aus zwei unabhängigen Experimenten normalen Mäusen stellen wir uns vor, dass bei Patienten mit verschiedenen Lungenerkrankungen die Lungennischen bereits teilweise erschöpft sein könnten und daher eine Transplantation eine weniger strenge Konditionierung erfordern könnte.

Ziel Charakterisierung von Stammzellkompartimenten in ihren Nischen in verschiedenen klinischen Situationen (nicht erkranktes im Vergleich zu emphysematösem und fibrotischem Lungengewebe) und Bewertung ihrer proliferativen und entwicklungsbezogenen Eigenschaften in vitro.

Weitere Implementierung des Lungen-Organoid-Kultursystems beim Arzneimittel-Screening und der Entwicklung von patientenindividueller Medizin.

Methoden Biopsien von Lungengewebe werden durch chirurgische Verfahren gewonnen: offene Lungenbiopsien. Dieses Verfahren wird routinemäßig zur histologischen Diagnose von fibrotischen Erkrankungen durchgeführt. Patienten mit Emphysem und fibrotischer Erkrankung im Endstadium haben ein höheres Risiko, an Lungenkrebs zu erkranken. Ein großer Teil der chirurgisch behandelten Lungenkrebspatienten hat ein Emphysem und eine fibrotische Erkrankung als histologischen Hintergrund. Lobektomie und Pneumonektomie werden häufig als Verfahren nach dem Stand der Technik in der chirurgischen Behandlung von Lungenkrebs durchgeführt. Ein Teil des resezierten Lungengewebes enthält emphysematöse und fibrotische Veränderungen oder lässt makroskopisch und mikroskopisch normal aussehen. Von diesen „nicht krebsartigen“ Bereichen werden Proben entnommen und in der Sheba Tissue Bank zusammen mit Proben aus fibrotischen und emphysematösen Bereichen zur Auswertung aufbewahrt. Die Biopsien werden durch Immunhistologie, FACS und 3D-Organoide (nach der Entfernung von Fibroblasten) im immunologischen Labor des Weizmann-Instituts analysiert.

Alle Proben werden nach den Unterschriften der informierten Einwilligung der Patienten sowohl auf dem dafür vorgesehenen Einwilligungsformular für dieses Protokoll als auch auf dem Gewebebankformular entnommen. Wir können bis zu 3-4 Patienten/Woche haben. Gesammelte Proben werden von erfahrenem Personal entweder aus der Abteilung für Thoraxchirurgie oder der Abteilung für Pathologie (als Teil ihrer Stellenbeschreibung in der Gewebebank) reseziert. Frische Proben werden zum Weizmann-Institut für FACS und IHC transportiert.

Da nur sehr begrenztes Wissen über menschliches Lungengewebe vorhanden ist, wird es obligatorisch sein, Lungengewebe von gesunden und erkrankten Lungen zu testen. Zunächst empfehlen wir, 10-15 normale Lungengewebe und 15-20 erkrankte Proben über einen Zeitraum von 2 Jahren zu testen. Wie zuvor erwähnt, werden die normalen Lungengewebe als "nicht krebsartige" Bereiche von Patienten erhalten, die sich einer Lobektomie/Pneumonektomie unterziehen.