Auswirkungen der Antibiotikabehandlung und -extraktion auf das orale Mikrobiom

Hypothese Eine Amoxicillin-Kur (250 mg, dreimal täglich für fünf Tage), die routinemäßig als Teil des Behandlungsprotokolls für Extraktionen von dritten Molaren verschrieben wird, verursacht eine signifikante Verschiebung des stabilen oralen Mikrobioms.

Die primären Ergebnismaße sind zu bewerten:

1. Relative Häufigkeit verschiedener Bakterien zu 5 festgelegten Zeitpunkten, bewertet durch 16 s r DNA-Gensequenzierung des oralen Mikrobioms.
2. Relative Häufigkeit und Expression bekannter Antibiotikaresistenzgene, bewertet durch einen Mikroarray bekannter resistenter Gene und funktionelle Metagenomik.

Sekundäre Ergebnismessungen sollen Folgendes bewerten:

1. Vorhandensein einer Entzündung in der Mundhöhle durch Messung der Konzentrationen von C-reaktivem Protein im Speichel zu 2 Zeitpunkten.
2. Klinische Anzeichen und Symptome vor und während der ersten Woche nach der Behandlung, um das Vorhandensein von Entzündungen und Infektionen zu überwachen.

Probanden, die für routinemäßige chirurgische Extraktionen vorgesehen sind und eine schriftliche Zustimmung zur Teilnahme an der Studie geben, werden rekrutiert. Ein erfahrener klinischer Bediener mit Facharztausbildung für Kiefer- und Gesichtschirurgie (ML Co-A) ist für die Durchführung der klinischen Behandlung verantwortlich. Die Verschreibung von Antibiotika richtet sich nach der Komplexität des Falles, der Schwierigkeit des operativen Eingriffs und dem Zeitaufwand. Daher werden die Patienten nicht randomisiert, sondern basieren auf der Gewinnung von 15 Patienten in jeder Gruppe. Dies ist keine Interventionsstudie und es gibt keine Risikogruppe, da die Patienten den erwarteten Behandlungsstandard erhalten. Speichel wird zu sieben Beobachtungszeitpunkten gesammelt (Basislinie, eine Woche, zwei Wochen, drei Wochen, ein Monat, drei Monate und sechs Monate) und supragingivale Plaqueproben werden zu vier Beobachtungszeitpunkten (Basislinie, eine Woche, ein Monat) entnommen , drei Monate ). Eine Kontrollgruppe von 15 Probanden, die sich keiner Zahnextraktion oder Antibiotikabehandlung unterziehen, wird nach Einholung der Einverständniserklärung rekrutiert und zu denselben sieben Zeitpunkten nachbeobachtet.

Die Probanden werden gebeten, ihre Zähne in der Nacht vor der Probenentnahme nicht zu putzen, und werden in ähnlicher Weise gebeten, keine zahnärztlichen Mundspülungen zu verwenden. Abgesehen von den Entnahmezeitpunkten werden die Probanden gebeten, ihre „normalen“, routinemäßigen Mundhygieneverfahren für die Dauer der Studie beizubehalten.

Sieben Zeitpunkte für die Entnahme von Speichelproben sind:

Grundlinie

1. Woche
2. Wochen
3. Wochen

1 Monat 3 Monate 6 Monate

Drei Zeitpunkte für die Entnahme von Plaqueproben sind:

Basis 1 Woche

1 Monat 3 Monate

Nach der Entnahme der Ausgangsproben wird die chirurgische Extraktion des dritten Backenzahns durchgeführt. Das Subjekt erhält nach der Extraktion Anweisungen und Analgetika zur Schmerzlinderung für alle Subjekte und Amoxicillin für diejenigen, die Antibiotika benötigen. Die Einhaltung wird überprüft, indem der Patient befragt und die Streifen der Tablettenhülle von Amoxicillin bei den Nachrufterminen überprüft werden. Der Proband wird gebeten, während des einmonatigen Studienzeitraums auf die Verwendung von Mundspülungen zu verzichten (sofern dies noch nicht geschehen ist), und es wird ihm eine Zahnpasta ohne antibakteriellen Inhalt zur Verfügung gestellt.

Jeder Proband wird einer grundlegenden parodontalen Untersuchung unterzogen, einschließlich Messungen der Sondierungstiefe, des klinischen Attachmentverlusts, des Gingivaindex, des Plaqueindex und der Zahnfleischreizung, und es wird sein Mundgesundheitsstatus aufgezeichnet.

Proben für die DNA-Extraktion werden zu allen angegebenen Zeitpunkten wie unten beschrieben entnommen. Die Proben werden morgens mindestens zwei Stunden nach den Mahlzeiten entnommen. Die Entnahme von Plaque- und Speichelproben erfolgt wie von Keijser et al. (13) beschrieben ), indem das Subjekt gebeten wird, Speichel passiv in das Gerät zu sabbern. Die Proben werden sofort in Eis gelegt und bei -800 °C gelagert. Eine sterile Mikrobürste wird verwendet, um supragingivale Plaqueproben von den bukkalen Zahnoberflächen zu entnehmen. Nach der Probenentnahme wird die Spitze der Bürste abgeschnitten und in einem Eppendorf-Röhrchen bei -80 °C aufbewahrt. Die supragingivale Plaque-Entnahme wird für sechs Zähne (16, 11, 24, 41, 36 und 44) ​​durchgeführt.

Speichelproben werden gevortext und zwei Sätze von 0,3-ml-Volumina werden in zwei sterile Eppendorf-Röhrchen mit zwei Deckeln mit 0,3-g-Zirkondioxid-Kügelchen überführt.

50 Mikroliter Speichel werden zur Messung der C-reaktiven Proteinspiegel zu Studienbeginn und nach einer Woche mit dem C-reaktiven Protein-ELISA-Kit (Salimetrics) verwendet.

Die Proben werden durch Zugabe von 0,2 ml Phenol und Verwendung eines Mini-Perlrührers für 2 Minuten homogenisiert. Die DNA wird mit einem DNA-Extraktionskit (Qiagen) extrahiert.

Die Amplifikation der hypervariablen Region V4 der 16s-r-RNA erfolgt mithilfe von Primern, und die Sequenzierung erfolgt mithilfe der MiSeq-Plattform.

Microarray für die resistenten Gene und funktionelle Metagenomik werden wie von Card et al. (14) beschrieben durchgeführt.

Behandlung der Probanden Dies ist eine prospektive Kohorten-Längsschnitt-Beobachtungsstudie zur Untersuchung junger Erwachsener, die sich einer chirurgischen Entfernung eines Weisheitszahns mit und ohne Antibiotika nach der Operation unterziehen. Postoperativ werden Antibiotika und Analgetika verabreicht.

Amoxicillin intraoral, dreimal täglich 250 mg für 5 Tage Analgetika – Arcoxia 120 mg für drei Tage und Paracetamol 500 mg QID PRN für 3 Tage oder Paracetamol 1 g plus 16 mg Codeinphosphat. Die Verschreibung von Antibiotika basiert auf einer klinischen Beurteilung auf der Grundlage der Komplexität des Falls, des Traumas und der Dauer des Verfahrens. Es wird keine Randomisierung durchgeführt. Speichel wird zu fünf Beobachtungszeitpunkten (Basislinie, eine Woche, zwei Wochen, drei Wochen und ein Monat) und supragingivale Plaqueproben werden zu drei Beobachtungszeitpunkten (Basislinie, eine Woche und ein Monat) gesammelt. Die Einhaltung wird überprüft indem Sie den Patienten fragen und die Streifen der Tablettenhülle von Amoxicillin bei den Nachrufterminen überprüfen.

Bewertung der Wirksamkeit Die Studie untersucht nicht die Wirksamkeit eines neuen Medikaments. Die durchgeführten Behandlungsverfahren entsprechen dem herkömmlichen Behandlungsprotokoll.

Bewertung der Sicherheit Die Studie befasst sich nicht mit der Sicherheit eines neuen Medikaments. Die durchgeführten Behandlungsverfahren entsprechen dem herkömmlichen Behandlungsprotokoll.

Statistische Analyse. Barcoded-Amplikonbibliotheken der hypervariablen Region des ribosomalen RNA-Gens V4 der kleinen Untereinheit werden für jede Probe unter Verwendung des V4-Vorwärtsprimers GTGCCAGCMGCCGCGGTAA und des V4-Rückwärtsprimers GGACTACHVGGGTWTCTAAT erzeugt, wie von Schloss in http://www.mothur.org/wiki/File beschrieben :Wet-lab_MiSeq_SOP.pdf. Die Amplikonbibliotheken werden in äquimolaren Mengen gepoolt und mit dem Illumina MiSeq-System sequenziert. Die Sequenzierungsdaten werden unter Verwendung einer Kombination aus QIIME (15)- und UPARSE (16)-Pipelines verarbeitet. Nach der Qualitätsfilterung werden die Reads mit UPARSE bei einer minimalen Sequenzähnlichkeit von 97 % in Operational Taxonomic Units (OTUs) geclustert. Der repräsentativen Sequenz jedes Clusters wird eine Taxonomie unter Verwendung des Ribosomal Database Project (RDP)-Klassifikators mit 80 % Vertrauen in QIIME zugewiesen.

Um Unterschiede in der Sequenzierungstiefe zu normalisieren, werden die Reads zufällig mit der gleichen Anzahl von Reads/Probe unterabgetastet. Datenreduktion durch Hauptkomponentenanalyse (PCA) an log2-transformierten OTU-Daten und Diversitätsstatistiken (Shannon Diversity Index), Bray-Curtis-Ähnlichkeitsindex, einseitige permutationsmultivariate Varianzanalyse (PERMANOVA) und Ähnlichkeitsprozentsatz (SIMPER) werden durchgeführt unter Verwendung der PAST-Software (17). PCA wird verwendet, um das potenzielle Mikrobiom-Clustering nach Behandlung und nach Besuch zu visualisieren. Der Shannon Diversity Index berücksichtigt die Anzahl der Taxa (OTUs) und den relativen Beitrag jeder OTU zum gesamten Datensatz. Der Bray-Curtis-Ähnlichkeitsindex liegt zwischen 0 und 1, wobei 1 bedeutet, dass zwei Proben die gleiche Zusammensetzung haben und 0 bedeutet, dass die beiden Proben keine Art gemeinsam haben. Dieser Index wird angewendet, um die Ähnlichkeit der Mikrobiome zwischen Besuch 1 (Basisprobe) und allen anderen Besuchen derselben Person zu bewerten. Diese Methode ermöglicht die zeitliche Quantifizierung der mikrobiellen Verschiebung. Der T-Test unabhängiger Stichproben wird verwendet, um die Mikrobiomverschiebungen zwischen den beiden Behandlungsgruppen zu vergleichen. PERMANOVA wird verwendet, um zu beurteilen, ob sich die Mikrobiomprofile zwischen den beiden Behandlungsgruppen statistisch signifikant unterscheiden. SIMPER wird verwendet, um die OTUs zu identifizieren, die am meisten zu den Unterschieden zwischen den Behandlungsgruppen beitragen.

Ergebnis der Mikrobiomanalyse:

Für jeden Probentyp (Plaque und Speichel) und jeden Zeitpunkt wird eine OTU-Tabelle mit normalisierten Lesezahlen pro Probe mit der entsprechenden taxonomischen Zuordnung für jede OTU enthalten sein; Shannon Diversity Index pro Einzelstichprobe und die oben erwähnten statistischen Analysen. Die Clusteranalyse mit gewichteten UniFrac-Metriken wird verwendet, um die relative Häufigkeit von Bakterien zu verschiedenen Zeitpunkten zu analysieren.

Zugriff auf Quelldaten/-dokumente Der Zugriff auf Quelldaten/-dokumente wird für studienbezogene Überwachung, Audits und IRB-Überprüfungen gestattet.

Qualitätskontrolle und Qualitätssicherung Zur Erfassung der Daten wird ein klinisches Standarduntersuchungsformular verwendet und von Verwaltungs- oder RA-Mitarbeitern eingegeben. Klinische Untersucher werden darin geschult, das Formular zu verwenden und klinische Beurteilungen auf der Grundlage von Beiträgen erfahrener Kliniker zu treffen und gegebenenfalls zu kalibrieren. Alle Zahnextraktionen werden von demselben erfahrenen Kliniker durchgeführt und die Probenentnahme wird von geschulten klinischen Untersuchern durchgeführt.

Ethik Die Verschreibung von Antibiotika basiert auf dem Urteil des Arztes und der Komplexität des Falls. Es werden keine ethischen Probleme erwartet, da dies eine akzeptierte und routinemäßige Behandlungsmethode ist.

Datenverarbeitung und Aufzeichnungen Daten werden von ausgewiesenen klinischen Prüfern erhoben, die in der Datenerhebung geschult und angewiesen werden. Verwaltungsmitarbeiter und wissenschaftliche Mitarbeiter erfassen die Daten. Gedruckte und elektronische Kopien der Aufzeichnungen werden vom Hauptermittler und einem weiteren Verwaltungsmitarbeiter aufbewahrt. Außer dem Forschungsteam wird kein Zugriff auf diese Daten gewährt.

Finanzierung und Versicherung Zahnmedizinische Fakultät der HKU (PG-Fonds)

Veröffentlichungspolitik Ergebnisse und Daten werden in internationalen Peer-Review-Zeitschriften und auf ähnlichen internationalen Konferenzen veröffentlicht.