PPAR-, RXR- und VDR-Ausdrücke bei Diabetes

Das vorliegende Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Ethikkommission der Tokat Gaziosmanpasa University genehmigt. Die Studie wurde als klinische Querschnittsstudie konzipiert und an der zahnmedizinischen Fakultät der Tokat Gaziosmanpaşa-Universität, Abteilung für Parodontologie, durchgeführt. Von allen Teilnehmern wurde eine Einverständniserklärung nach Aufklärung eingeholt, und eine ausführliche mündliche und radiologische Untersuchung wurde von einem erfahrenen Kliniker (H.B.Y.) durchgeführt.

Zweiundvierzig Teilnehmer, 14 Teilnehmer in jeder Gruppe, wurden in die Studie aufgenommen. Die Studiengruppen waren wie folgt.

Gesunde Kontrollen (C, mittleres Alter 41,05 ± 1,80, sieben Männer, sieben Frauen) Parodontitis-Patienten im Stadium 3 Grad B, (P, mittleres Alter 42,35 ± 1,92, sieben Männer, sieben Frauen) Patienten mit Diabetes und Parodontitis im Stadium 3 Grad C, (DP, mittleres Alter 41,09 ± 1,28, sieben Männer, sieben Frauen)

Alle Patienten und gesunden Personen wurden einer detaillierten mündlichen Untersuchung unterzogen, und die Diagnose der parodontalen Gesundheit und Parodontitis basierte auf den Kriterien, die durch die jüngste Klassifikation der parodontalen Gesundheit und Erkrankungen auf dem International World Workshop for a Classification of Parodontal Diseases and Conditions 2017 definiert wurden [21]. .

Alle Teilnehmer waren nie Raucher. Ausschlusskriterien waren Zustände, die den Entzündungszustand beeinflussen könnten, das Vorhandensein von weniger als zehn oder mehr fehlenden Zähnen, Tabak- oder Drogenkonsum, das Vorhandensein einer Schwangerschaft oder Stillzeit und das Bestehen einer Antibiotika- oder Parodontaltherapie innerhalb der letzten sechs Monate. Diabetespatienten in der vorliegenden Studie hatten HbA1c-Werte über 7,0, obwohl sie unter Diabetesbehandlung standen. Und die Diabetiker, die HbA1c-Werte unter 7,0 hatten, wurden nicht eingeschlossen.

Klinische Messungen Klinische Parameter waren Plaqueindex (PI), Gingivaindex (GI) und klinische Attachmentgrade (CAL), und alle Analysen wurden vor dem Biopsieverfahren durchgeführt. Vollmundmessungen und die Messungen der relevanten Zähne wurden separat aufgezeichnet. CAL wurde von der Zement-Schmelz-Grenze bis zum Boden der periodontalen Tasche gemessen, und für die Messungen wurde eine parodontale Sonde vom Williams-Typ verwendet (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, USA). PI- und GI-Messungen wurden über einen Explorer (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, USA) durchgeführt. Alle Analysen wurden von sechs Punkten aus durchgeführt, drei von der bukkalen Seite und drei von der palatinalen Seite als mesiale, mittlere und distale Stelle für beide Zähne. Es wurde ein Mittelwert aus sechs Messungen aufgezeichnet.

Entnahme von Zahnfleischproben Zahnfleischbiopsien wurden gemäß einem Protokoll einer früheren Studie entnommen [22]. Von jedem Teilnehmer wurden zwei Zahnfleischbiopsien entnommen. Zahnfleischentnahmen bei parodontal gesunden Personen wurden durch Kronenverlängerungsverfahren im Routinebehandlungsprotokoll oder vor einer kieferorthopädisch indizierten Zahnextraktion durchgeführt. In den Parodontitis-Gruppen wurden Biopsien aus dem entzündeten Zahnfleischgewebe mit kleineren chirurgischen parodontalen Eingriffen gewonnen. Alle Biopsien wurden von hinteren Oberkieferzähnen (Zahn Nr. 4, Nr. 5, Nr. 6 oder Nr. 7) erhalten.

Zunächst wurde eine Lokalanästhesie durchgeführt und eine Zahnfleischprobe mit einer Gewebeschere aus einem Bereich präpariert, in dem entweder Gingivektomie/Kronenverlängerungsverfahren bei Patienten mit gestörter Gingivatopographie oder vor Zahnextraktion, die für eine kieferorthopädische Behandlung bei gesunden Personen indiziert war, erforderlich waren. Wie bei den Parodontitis-Patienten wurde während des Scaling- und Wurzelplanungsverfahrens aus den Zahnfleischbereichen mit starker Zahnfleischentzündung eine Zahnfleischprobe mit einer Gewebeschere präpariert. Eine Zahnfleischprobe von jedem Teilnehmer wurde sofort für 48 Stunden in 10 % neutral gepuffertes Formalin gelegt und einer histologischen Gewebeverarbeitung unterzogen. Die anderen Proben jedes Teilnehmers wurden sofort bis zum Tag der Analyse bei -80⁰C eingefroren.

Histopathologische Auswertung Alle histologischen Verfahren wurden von einem erfahrenen verblindeten Forscher (F.G.) durchgeführt. Zahnfleischproben, die einer histologischen Gewebeverarbeitung unterzogen wurden, wurden zuerst gewaschen und von Formalin gereinigt und mit einer Alkoholreihe dehydriert. Dann wurden alle Gewebe mit Xylol gereinigt und in Paraffinblöcke eingebettet. Jeder Block wurde durchgehend als Serienschnitte geschnitten und drei Schnitte von jedem Block wurden für die Hämatoxylin-Eosin (H&E)-Färbung ausgewählt. Die Infiltration von Fibroblasten und entzündlichen Zellen wurde von H&E-gefärbten Objektträgern unter 1000-facher Vergrößerung über ein Lichtmikroskop bewertet.

Für die Bewertung von Fibroblasten und Entzündungszellen wurde der gingivale Bereich an der Bindegewebsgrenze benachbart zum gingivalen Epithel bewertet. Unter 1000-facher Vergrößerung wurde ein Zellzählrahmen mit einer Fläche von 10.000 µm2 ausgewählt. Die gesamten Entzündungszellen (Neutrophilen-, Lymphozyten-, Eosinophilen- und Makrophagenzellen) innerhalb des Rahmens wurden als Zählung der Entzündungszellen gezählt. Ebenso wurden die Fibroblasten gezählt. Die Messungen wurden von drei verschiedenen Punkten durchgeführt, und der Mittelwert dieser drei Messungen wurde aufgezeichnet [23].

PPAR-γ, RXR-α und VDR Immunhistochemie Die Immunhistochemie wurde wie in früheren Studien beschrieben durchgeführt [23-26]. Für jede immunhistochemische Färbung von jedem Teilnehmer wurden drei Schnitte ausgewählt. Zunächst wurden alle Objektträger entparaffiniert und mit Alkoholreihen entwässert. Nach dem Waschen mit destilliertem Wasser wurde die Antigengewinnung über Natriumcitratpuffer (pH 6,0) für zwei Stunden bei 70 °C durchgeführt, und dann wurde die endogene Peroxidaseaktivität mit einer Behandlung mit 3 % Wasserstoffperoxid unterdrückt. Nach der Behandlung mit Wasserstoffperoxid wurden alle Objektträger mit normalem Kaninchenserum für 30 min inkubiert. Nach normaler Seruminkubation wurden Verdünnungsmittel für primäre Antikörper hergestellt und über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei 4°C auf die Proben aufgetragen. Die primären Antikörper waren polyklonale Ziegen-Anti-PPAR-γ-Antikörper (1:250), Anti-RXR-α-Antikörper (1:250) und Anti-VDR-Antikörper (1:250). Nach der Inkubation des primären Antikörpers wurden alle Objektträger mit Phosphatpufferlösung (PBS) dreimal für fünf Minuten (3 x 5) gewaschen und biotinyliertes Immunglobulin G wurde für 30 Minuten aufgetragen. Wieder eine Waschung mit 3 × 5 PBS, alle Proben wurden weitere 30 min einem Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Reagenz ausgesetzt. Nach dem Waschen mit 3x5 PBS wurden alle Schnitte mit AEC-Chromogen behandelt, um die Färbung sichtbar zu machen. Gegenfärbung wurde mit Meyers Hämatoxylin durchgeführt, und die Schnitte wurden montiert. Nach zweitägigem Trocknen wurden die Proben unter 400-facher Vergrößerung lichtmikroskopisch untersucht [23, 24].

Immunhistochemische semiquantitative H-SCORE-Analyse Die immunhistochemische Bewertung wurde an drei verschiedenen Bereichen in jedem Abschnitt durchgeführt, und drei Abschnitte wurden für jeden Patienten bewertet. Für jeden Teilnehmer wurden neun Messungen durchgeführt. Alle Zellen wurden entsprechend ihrer Färbung als keine Färbung „0“, geringe Färbung „1“, leichte Färbung „2“ und dichte Färbung „3“ markiert. Färbungs-Scores wurden durch eine Formel (∑Pi(i+l)), die ein häufig verwendeter Wert für die Immunhistochemie ist, in einen numerischen Wert als „H-Score“ umgewandelt [23, 24]. In dieser Formel zeigt i die Bewertung der Färbeintensität und Pi: gibt den Prozentsatz der gefärbten Zellen an.

RT-PCR-Analyse Die für die Gene zu verwendenden Primer sind in Tabelle 1 gezeigt. Die RNA-Isolierung und die RT-PCR-Analyse wurden gemäß einer früheren Studie durchgeführt [27]. Kurz gesagt, für die RT-PCR-Analyse wurden zunächst Zahnfleischgewebe homogenisiert und einer Beschallung unterzogen, um RNA in den Geweben freizulegen, und es wurden Gewebeüberstände erhalten. Dann wurden die Überstände dem Gesamt-mRNA-Isolierungsschritt unterzogen. Die mit Qiazol behandelten Gewebe werden dann für 5 Minuten im Schüttler inkubiert. Am Ende der 5 Minuten wurde Chloroform zu dem die Zellen enthaltenden Medium gegeben und die Inkubation für 3 Minuten bei Raumtemperatur fortgesetzt und dann wurden die Proben zentrifugiert. Am Ende der Zentrifuge wird der Überstand oben im Röhrchen in ein anderes Röhrchen überführt. Anschließend wurde der Überstand mit Isopropanol versetzt, 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und der Zentrifugationsschritt wiederholt. Am Ende der Zentrifugation wurde das unten abgelagerte Pellet mit 75 % Ethanol gewaschen, der verbleibende Überstand erneut zentrifugiert und in reinem, sterilem Wasser ohne RNase suspendiert. mRNAs wurden durch spektrophotometrische Verfahren bestimmt. Dann wurde mit dem qRT-PCR-Kit ein µg mRNA in Einzelschritt-cDNA transformiert, wobei spezifische Primer verwendet wurden, die auf das interessierende Gen abzielten, später wurden die Gene mit Hilfe von qRT-PCR identifiziert (Verso, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) . Die Ergebnisse wurden auf das β-Aktin-Kontrollgen normalisiert.

Statistische Analyse Die Aussagekraft der Studie lag bei über 85 % basierend auf einer früheren Studie mit ähnlichem Studiendesign [25]. Für die statistische Analyse wurde IBM SPSS-Software verwendet. Ein Proben-K-S-Test wurde verwendet, um die Normalität zu testen. Für die Fibroblastenzellzählungen, Entzündungszellzählungen und CAL wurde eine Einweg-ANOVA gefolgt von einem Tukey-Test verwendet. Für andere Parameter wurden Mann-Whitney-U- und Kruskal-Wallis-Tests verwendet. Die Daten wurden je nach Bedarf als Mittelwert ± Standardabweichung oder Prozentsatz dargestellt. p < 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet.