Bewertung des Tumorwachstums und der onkologischen Behandlung bei Patienten mit CRLM unter Verwendung des Zebrafisch-Embryomodells (CRLM-Z)

Die Möglichkeiten zur Vorhersage des onkologischen Tumoransprechens für einzelne Patienten mit gastrointestinalen Malignomen, um eine personalisierte onkologische Behandlung maßzuschneidern, sind derzeit begrenzt. Dies bedeutet, dass die meisten Informationen, die zur Entscheidung über eine onkologische Behandlung herangezogen werden, sich auf eine Gruppe von Patienten und nicht auf Einzelpersonen beziehen. Ebenso sind die meisten verwendeten Chemotherapieschemata nicht individuell zugeschnitten, obwohl sich gezeigt hat, dass sie für bestimmte Kohorten von Patienten von Vorteil sind. Bei Darmkrebs sagen der KRAS- (Kirsten-Ratten-Sarkom) und der BRAF-Mutationsstatus die Reaktion auf Medikamente voraus, die auf verschiedene Schritte im EGFR/KRAS/BRAF-Signalweg abzielen, während der MSI/MMR-Status das Ergebnis von Immun-Checkpoint-Inhibitoren vorhersagen kann [1]. Da eine Chemotherapie sowie andere Krebsbehandlungen schwerwiegende Nebenwirkungen haben können, kann die Behandlung nicht nur unwirksam sein, sondern auch schwerwiegende unerwünschte Ereignisse verursachen, die sogar das Leben des Patienten verkürzen und die Chance einer kurativen Tumorresektion beeinträchtigen. Aus diesem Grund wäre die Bewertung der Reaktion vor der Behandlung in einem Avatar-Modell von Zebrafischen am wertvollsten.

Aus klinischer Sicht ist die Situation im adjuvanten Setting am einfachsten. An diesem Punkt steht der gesamte Tumor zur Analyse zur Verfügung und größere Gewebestücke können im Avatar-Modell verwendet werden. 5-Fluorouracil oder Capecitabin (ein 5-FU-Prodrug) entweder allein oder in Kombination mit Oxaliplatin ist die derzeitige adjuvante Standardbehandlung bei Dickdarmkrebs im Stadium III und bei Dickdarmkrebs im Stadium II mit 2+ Risikofaktoren. Andere Arten von Kombinationstherapien, einschließlich z.B. Irinotecan hat bisher keinen Nutzen in der adjuvanten Situation gezeigt.

Im neoadjuvanten Setting, d. h. präoperative Behandlung von Patienten mit resektablem CRLM, können Kombinationen aus 5-FU (oder Capecitabin) und entweder Oxaliplatin oder Irinotecan das Ergebnis der Operation und die Langzeitprognose verbessern. Es ist derzeit nicht bekannt, welches Regime für den einzelnen Patienten am effizientesten ist.

Im schwersten Fall, wenn der Patient sich mit inoperablem CRLM vorstellt, ist entweder eine palliative Chemotherapie oder eine Downsizing-/Konversionschemotherapie indiziert. Für die letztere Patientengruppe ist es von größter Bedeutung, eine möglichst wirksame Behandlung in erster Linie bereitzustellen, da die 10

Das therapeutische Fenster ist eng und eine weitere klinische und/oder radiologische Progression der Erstlinientherapie kann weitere onkologische und chirurgische Eingriffe ausschließen. Gesunde Patienten können von einem Triplett aus 5-FU, Oxaliplatin und Irinotecan (FOLFOXIRI) profitieren. Dies ist jedoch ein toxisches Regime, und älteren oder weniger fitten Patienten wird häufiger eine Kombination aus 5-FU und entweder Oxaliplatin oder Irinotecan angeboten. Es kann einen zusätzlichen Wert haben, wenn die Chemotherapie mit Antikörpern kombiniert wird, die auf VEGF oder, für solche Tumoren, die Wildtyp-KRAS exprimieren, den EGF-Rezeptor abzielen.

Aber vielleicht wäre die wertvollste Einstellung für den Patienten mit einer im Voraus nicht resezierbaren Tumorlast, bevor eine Behandlung begonnen hat.

Bis zu 50 % der Patienten mit Darmkrebs entwickeln Lebermetastasen entweder synchron oder metachron in Bezug auf die Erkennung des Primärtumors[2]. Die Hauptstütze der Behandlung ist heute eine Kombination aus Resektion +/-Ablation von Metastasen, mit oder ohne präoperativer Lebervolumenaugmentation und Chemotherapie, manchmal in Kombination mit Antikörpern [3].

Sowohl in Bezug auf das Tumorwachstum als auch in Bezug auf das Muster von Onkogenen in den Tumoren wurden eine Reihe negativer prognostischer Faktoren identifiziert [4]. Einer der wichtigsten Faktoren ist jedoch das Ansprechen der Metastasen auf die Chemotherapie sowohl radiologisch als auch in der Reduktion von Tumormarkern (CEA, CA19/9) [5, 6].

Noch wissen wir sehr wenig, ob die Metastasen auf die gegebene Therapie ansprechen werden oder nicht. Tumore mit KRAS-Mutation sprechen nicht auf die Behandlung mit Erbitux an, und muzinöse Tumore sind in der Regel resistenter gegen jede Chemotherapie[7].

Verschiedene Modelle wurden untersucht, um das tumorspezifische Ansprechen auf die Behandlung zu bewerten, aber die meisten sind langsam oder haben gemischte Ergebnisse gezeigt[8]. Heutzutage ist das von Patienten stammende Maus-Xenograft-Modell (PDX) das am häufigsten verwendete und validierte Modell, um das Ansprechen auf die Therapie vorherzusagen, aber die Bewertung der onkologischen Therapie dauert Monate [9]. Daher kann das Maus-PDX-Modell nicht für die klinische Entscheidungsfindung verwendet werden. Organoide Kulturen mit von Patienten stammenden Krebsarten sind ein weit verbreitetes In-vitro-Screening-Tool mit vielversprechenden Ergebnissen für verschiedene Tumoren[10]. Organoide erhalten die genetischen Eigenschaften des ursprünglichen Tumorgewebes. Dennoch sind diese Modelle langsam, wenn es darum geht, das Gewebe von Patienten für Behandlungsentscheidungen zu bewerten, und es fehlt ihnen die Fähigkeit, metastatische oder angiogene Potenziale zu bewerten.

Kürzlich wurden Zebrafischembryos als Avatare für menschlichen Krebs verwendet, zunächst bei hämatogenen Krebsarten, aber in letzter Zeit auch bei soliden Krebsarten wie PDAC, Brustkrebs und Darmkrebs [11-14].

Das Modell hat mehrere Vorteile, der stärkste ist die Bewertung des Ansprechens nur 3-5 Tage nachdem das Tumorgewebe in die Embryonen implantiert wurde. Die Embryonen sind transparent, sodass Tumorwachstum und -ausbreitung im Detail visualisiert und halbautomatisch quantifiziert werden können[15]. Da das eigene Immunsystem des Zebrafischembryos erst am 8. Tag reagiert [14], weshalb die Immunantwort gegen den Tumor von den eigenen Immunzellen des Patienten kommt, ist dies auch der Grund, warum die Xenograft-Verpflanzung in diesem Modell funktioniert. Auf der anderen Seite. Bisher reicht Biopsiegewebe nicht aus, aber es wird mindestens ein Kubikzentimeter Tumorgewebe benötigt, um diese Avatare zu erzeugen. Aus diesem Grund liefern Nadelbiopsien nicht genügend Material, aber resezierte Lebertumorgewebe werden in den aktuellen Protokollen benötigt.

In Zebrafischembryos wurde gezeigt, dass kolorektale Krebszellen wachsen, und die Bewertung des Ansprechens verschiedener Chemotherapie-Kombinationen war erfolgreich und korrelierte sehr gut mit dem Ansprechen beim Menschen [14]. Klinische Studien zu kolorektalen Lebermetastasen wurden bisher nicht durchgeführt.

Die Fische werden bei einer Durchschnittstemperatur von 28 °C in einem Kreislaufsystem mit einem 14:10-Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Befruchtete Eier von Zebrafischen werden durch natürliche Paarung des Wildtyp-AB-Stammes in unseren Einrichtungen gewonnen, und die sich entwickelnden Embryonen werden gemäß Kimmel et al[19] bei 28 °C im Inkubator inszeniert. Vor jedem Eingriff werden die Embryonen in 0,02% Tricain betäubt. Das vom Histopathologen aus der chirurgischen Probe entnommene Tumorgewebe wird kryokonserviert, indem das Gewebe in Kryokonservierungsmedium enthaltende Kryoröhrchen getaucht, die Röhrchen in eine Kryobox gegeben und die Box für mindestens 24 Stunden in einen -80-Grad-Gefrierschrank gestellt werden. Das Röhrchen mit Gewebe wird dann auf Trockeneis zum Zebrafischlabor transportiert, wo das Gewebe aufgetaut, gewaschen und in einer Proteasemischung in einem mechanischen Disaggregationsgerät (GentleMACS) inkubiert wird, um eine Einzelzellsuspension aus dem Gewebe herzustellen. Die Suspension wird filtriert und für 30 min in 40 &mgr;g/ml CM-Dil in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) inkubiert, gefolgt von Zentrifugation und Waschen mit PBS. Die markierten Zellen werden dann in Implantationsmedium resuspendiert und unter Verwendung von dünnen Glaskapillarnadeln in das subkutane Perivitellin-Kompartiment von 2 Tage alten Zebrafischembryos injiziert. Erfolgreich implantierte Zebrabärblingsembryos werden dann auf Embryomedium übertragen, das die zu untersuchenden Medikamente enthält (z. B. die Medikamente, die für die Behandlung des Patienten, der die Probe spendet, in Betracht gezogen werden könnten) und drei Tage lang behandelt. Bilder der Tumore werden sowohl unmittelbar nach der Transplantation als auch nach der dreitägigen Behandlungsdauer aufgenommen, und ein zusätzliches Bild der Hauptmetastasenstelle im Zebrafischembryo wird nach der dreitägigen Behandlungsdauer aufgenommen, um die Metastasierungsfähigkeit der Zellen zu bewerten. Das Behandlungsergebnis wird als Veränderung des Tumorvolumens zwischen Tag 3 und Tag 0 in der Behandlungsgruppe im Vergleich zur Trägerkontrollgruppe (Prozent) bewertet, und eine signifikant stärkere Verringerung des Tumorvolumens in der Behandlungsgruppe wird als positives Behandlungsergebnis gewertet . Der Nachweis eines pro-metastatischen Phänotyps wird aus der Anzahl der Zellen abgeleitet, die an der metastatischen Stelle in den Zebrafischembryos drei Tage nach der Implantation gefunden werden. Die Cut-off-Werte dafür, wie viele metastasierte Zellen erforderlich sind, um eine wahrscheinliche Metastasenprogression bei dem Patienten vorherzusagen, werden bei den ersten 10–20 eingeschlossenen Patienten bewertet, da solche Informationen derzeit nicht aus anderen Informationsquellen verfügbar sind.