Entwicklung einer Pipeline zum Einsatz von RNA-Seq als ergänzendes Diagnosetool bei seltenen Krankheiten (ANTHEM)

Bei seltenen genetischen Erkrankungen handelt es sich um eine sehr heterogene Gruppe von Krankheiten, die häufig nicht diagnostiziert werden und bei denen Patienten nur eine symptomatische Behandlung erhalten. Die Entwicklung der Massensequenzierungstechnologie der nächsten Generation (Next-Generation-Sequencing; NGS) hat es ermöglicht, viele der für diese Pathologien verantwortlichen Gene zu identifizieren und die pathogenen Mechanismen aufzuklären. Die am häufigsten verwendeten Methoden wie die Exomsequenzierung (Whole-Exome Sequencing; WES) oder die Genomsequenzierung (Whole-Genome Sequencing; WGS) basieren auf der DNA-Sequenzierung und ermöglichen die Identifizierung pathogener Mutationen, die zum Verlust der Proteinfunktionalität führen, wie z Stoppen Sie Mutationen, große Insertionen und Deletionen und den Verlust kanonischer Spleißstellen. Umgekehrt ist die Zuordnung der Pathogenität zu einer Aminosäuresubstitutionsvariante (Missense) oder einer synonymen Variante oft fraglich und daher werden solche Varianten oft als Varianten unbekannter Bedeutung (VUS) kategorisiert. Darüber hinaus ist die Exomsequenzierung nicht in der Lage, mögliche pathogene Varianten zu identifizieren, die sich in nicht-kodierenden Regionen befinden, wie etwa nicht-kanonischen Spleißstellen oder tief intronischen Varianten.

Die WGS-Sequenzierung ermöglicht zwar die Identifizierung von Varianten, die in den nicht-kodierenden Regionen eines Gens vorhanden sind, ist jedoch sehr teuer und erzeugt eine enorme Datenmenge mit geringen pathogenen Informationen. Algorithmen zur Analyse der möglichen Pathogenität intronischer Varianten haben eine geringe Vorhersagekraft und die Pathogenität der identifizierten Varianten muss durch langwierige und komplexe Funktionsanalysen validiert werden. Aufgrund dieser Einschränkungen bleiben etwa 50 % der Patienten mit seltenen genetischen Erkrankungen unerkannt und können nicht von den Vorteilen der personalisierten Medizin profitieren. Die Transkriptomsequenzierung (RNA-Seq) ermöglicht die Bestimmung von Variationen in der Sequenz und den Mengen der RNA und liefert ergänzende Informationen zu den mit WES und WGS erhaltenen Informationen, wodurch die Effizienz der genetischen Diagnose verbessert wird. Spleißveränderungen, die zu den Hauptursachen genetischer Erkrankungen zählen und sowohl in tiefen Intronregionen als auch in kodierenden Regionen vorkommen können, können durch RNA-Sequenzierung identifiziert werden. Auch Varianten in den regulatorischen Regionen des Gens, die die RNA-Expressionsniveaus beeinflussen können, können durch RNA-Seq hervorgehoben werden. Da die RNA-Expression hinsichtlich der durch alternatives Spleißen erzeugten Mengen und Isoformen gewebespezifisch ist, ist das betroffene Gewebe sicherlich das transkriptionell aussagekräftigste biologische Material. Dies ist jedoch nicht immer einfach zu erreichen und die Entnahme kann für den Patienten zu invasiv sein. In diesen Fällen ist es möglich, auf die Verwendung alternativer Gewebe wie Vollblut oder Hautbiopsien zurückzugreifen, die eine geringe Invasivität und ein breites RNA-Expressionsprofil aufweisen. Insbesondere aus Hautbiopsien gewonnene Fibroblasten haben sich bei einer Vielzahl von Pathologien als die zuverlässigste, homogenste und aussagekräftigste Alternativmatrix für die RNA-Seq-Analyse erwiesen. Yépez und Mitarbeiter zeigten, dass die durch RNA-Seq aus Hautfibroblasten gewonnenen Informationen denen aus Blut überlegen waren. Darüber hinaus ermöglichte die Analyse des Transkriptoms von Hautfibroblasten die Identifizierung veränderter Transkriptniveaus und Spleißanomalien bei neuromuskulären und neurologischen Entwicklungskrankheiten. Dies bestätigte die Wirksamkeit der Verwendung von Hautfibroblasten bei der Diagnose genetischer Pathologien bei WES- und WGS-negativen Patienten. Nicht zuletzt können Hautfibroblasten für mögliche zukünftige Analysen in andere Zelltypen umprogrammiert werden.

Dieses Projekt zielt darauf ab, mithilfe der RNA-Seq-Technologie die genetischen Veränderungen zu identifizieren, die nicht diagnostizierten seltenen Krankheiten bei pädiatrischen und erwachsenen Patienten mit frühem Beginn und negativem WES zugrunde liegen.

Obwohl NGS für die Diagnose genetischer Erkrankungen unerlässlich ist, liegen die Erfolgsraten zwischen 30 und 50 %. Das Aufkommen von RNA-Seq erhöhte die Wahrscheinlichkeit, genetische Krankheiten zu diagnostizieren, von 8 % auf 36 %. Mit diesem Projekt beabsichtigen wir, die RNA-Seq-Methode als Integration der WES-Analyse zur Diagnose seltener genetischer Erkrankungen anzuwenden:

• Ziel 1: Techniken einrichten und validieren. Aufbau und Validierung des Transkriptom-Analyseprotokolls bei gesunden Probanden und bei Patienten mit bekannten Spleißveränderungen und/oder veränderter RNA-Expression.
• Ziel 2: Diagnosephase. Untersuchung von Spleißveränderungen und RNA-Spiegeln in kultivierten Fibroblasten, die aus Hautbiopsien von Patienten mit seltenen genetischen Erkrankungen und negativem Exom gewonnen wurden.

Explorationsziele.

• Vergleichen Sie das RNA-Expressionsprofil aus Hautbiopsie-abgeleiteten Fibroblasten mit dem RNA-Expressionsprofil aus Blut. Die relevantesten Ergebnisse werden in der qRT-PCR validiert.
• Analyse der Heterogenität des Transkriptions- und Proteinprofils in aus der Haut stammenden Fibroblasten bei eingeschriebenen Probanden.

Untersuchung der Auswirkungen genetischer (von WES) und transkriptioneller (von RNA-seq) Veränderungen im Plasma und Serum der Teilnehmer.

Gesunde Kontrollen. Aus dem Personal des Mario Negri-Instituts für pharmakologische Forschung werden fünf gesunde Probanden rekrutiert. Um den Schutz der Kategorie der gesunden Freiwilligen zu gewährleisten, ist vorgesehen, dass die Einschreibung dem Gesundheitspersonal des Daccò-Zentrums anvertraut wird, das alle Mitarbeiter des Instituts per E-Mail über die Möglichkeit einer spontanen Teilnahme an der Studie informiert . An der Rekrutierung von Freiwilligen wird kein Manager oder Tutor beteiligt sein. Als weitere Garantie für die Vertraulichkeit werden für die Zwecke der Studie die Proben gesunder Freiwilliger in codierter Form behandelt. Die codierten Proben werden verwendet, um die Methode zur Isolierung und Kultur von Hautfibroblasten und RNA-Seq. festzulegen.

Validierungsgruppe. Für den Aufbau und die Validierung der Hautfibroblasten-Isolierung und des RNA-Seq-Verfahrens werden zehn erwachsene Patienten mit bekannter Diagnose und mit Veränderungen der RNA-Spiegel und/oder des Spleißens als Positivkontrollen rekrutiert.

Dazu gehören Patienten mit atypischem hämolytisch-urämischem Syndrom (aHUS), membranoproliferativer Glomerulonephritis (MPGN), autosomal-dominanter polyzystischer Niere (ADPKD) oder anderen seltenen Pathologien, die zuvor im Daccò-Zentrum diagnostiziert wurden und der Sammlung zugestimmt haben Konservierung (UNI EN ISO 9001 seit 2016; Zertifizierungsnr. 6121) der Proben in der zertifizierten Biobank (Mario Negri Biological Resources Center – Biobank für seltene und Nierenerkrankungen). Patienten, die die oben beschriebenen Anforderungen erfüllen, werden von den Ärzten des Daccò-Zentrums für ein Interview zur Erläuterung des Projekts kontaktiert. Diejenigen, die der Teilnahme an der Studie zustimmen, werden gebeten, die Einverständniserklärung zu unterzeichnen, bevor sie mit dem experimentellen Teil fortfahren.

Gruppe „Entdeckung/Erkundung“. Die Explorationskohorte wird aus 30 symptomatischen undiagnostizierten Patienten mit Verdacht auf eine genetische Erkrankung (Kinder und Erwachsene mit infantilem Beginn) bestehen, die zum klinischen Zentrum des Mario Negri-Instituts für pharmakologische Forschung gehören und bei denen WES-Untersuchungen keine ursächlichen genetischen Veränderungen ergeben haben. Zu diesem Zweck planen wir die Rekrutierung von etwa 60 Patienten, deren Eltern und, sofern verfügbar, informativere Familienmitglieder, die, sofern noch nicht geschehen, von WES analysiert werden. Basierend auf der Literatur und unserer Erfahrung gehen wir davon aus, dass die WES-Analyse in 40–50 % der Fälle kurativ sein wird (Lunke et al., 2023). Daher gehen wir davon aus, 30 Patienten mit negativem WES zu identifizieren, die somit in die „Discovery/Exploration“-Kohorte aufgenommen werden können.

Nach Unterzeichnung der Einverständniserklärung zur Sammlung und Lagerung von Proben (UNI EN ISO 9001 seit 2016; Zertifizierungsnr. 6121) in der zertifizierten Biobank (Mario Negri Biological Resources Center – Biobank für seltene und renale Krankheiten) und nach der Sammlung klinischer Informationen, Patienten werden in das Projekt aufgenommen.

Blut- und Hautbiopsieproben zur DNA- und Fibroblastenisolierung werden wie unten beschrieben entnommen.

Für die WES-Analysen werden 3 Röhrchen mit 3 ml Vollblut in EDTA von Erwachsenen und 2 Röhrchen mit 3 ml Vollblut in EDTA von Kindern entnommen und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert. Die Blutentnahme erfolgt im Mario Negri Institute-Daccò Center.

Die WES-Analysen werden im Klinischen Forschungszentrum für seltene Krankheiten „Aldo e Cele Daccò“ oder in einem spezialisierten externen Labor durchgeführt, das unter unserer Verantwortung ausgewählt wird.

Zur explorativen Analyse wird ein zusätzliches 3-ml-Aliquot Vollblut in TempusTM-Blut-RNA-Röhrchen entnommen.

Im „Mario Negri Biological Resource Center – Rare Diseases and Kidney Diseases Biobank“ wird eine Forschungsbiobank mit biologischem Material in Form von Blut, Serum und Plasma eingerichtet.

Beim ersten Besuch unterzeichnen die Patienten ein studienspezifisches Einverständnisformular, das spezifische Informationen und Optionen zur Teilnahme an der Forschungsbiobank enthält, einschließlich der Möglichkeit, die Proben in Zukunft für weitere Forschungsstudien zu verwenden.

Wenn die Probanden ihr Einverständnis geben, werden Aliquots von Serum und Plasma (1 x 2 ml Plasma, 1 x 2 ml Serum) gesammelt und in codierter Form in der Biobank gespeichert.