Ccf mtDNA como biomarcador neurodegenerativo

Hasta la fecha, las causas específicas de la esclerosis múltiple (EM) siguen siendo inciertas, y en su patogenia se ha implicado una interacción entre factores ambientales y genéticos que conducen a la inflamación, desmielinización y neurodegeneración del sistema nervioso central (SNC). Los estudios epidemiológicos realizados en grupos étnicos de familias, mellizos, medios hermanos y parejas conjugadas sustentan un componente genético en este proceso. El riesgo de gemelos monocigóticos es 300 veces mayor, y para familiares de primer grado de 20 a 50 veces mayor que para un individuo en la población general de origen del norte de Europa con una tasa de prevalencia de 0,1. Los patrones de transmisión observados no son compatibles con una herencia autosómica dominante, recesiva o ligada al cromosoma X. La EM es un trastorno de rasgos complejo, definido por varios genes, cada uno de los cuales ejerce un efecto pequeño y en una interacción con el medio ambiente. Las expresiones fenotípicas de la EM sugieren la participación de mecanismos complejos con características de autoinmunidad y neurodegeneración. Los fármacos modificadores de la enfermedad actualmente aprobados se dirigen principalmente a los componentes inflamatorios, pero ejercen un efecto limitado sobre la neurodegeneración en la EM. El deterioro cognitivo puede ser una característica temprana del proceso de la enfermedad desmielinizante y, en algunos casos, se ha documentado demencia en ausencia de signos neurológicos graves. Existe cierta correlación entre el subtipo de enfermedad y el deterioro cognitivo: de hecho, es bien sabido que el deterioro cognitivo ocurre con mayor frecuencia y es más grave en pacientes con EM progresiva que en pacientes con EM remitente-recurrente. El deterioro de los dominios cognitivos como la memoria, la velocidad de procesamiento mental, la atención y la función ejecutiva puede ocurrir desde la etapa temprana de las enfermedades y tiende a empeorar con el tiempo. Además, los mecanismos fisiopatológicos subyacentes del deterioro cognitivo y los trastornos neuropsiquiátricos observados en la EM no se conocen por completo. Las anomalías de la sustancia blanca por sí solas no pueden explicar por completo el alcance de los síntomas clínicos de la EM, incluido el deterioro cognitivo. Además, varias técnicas de resonancia magnética han demostrado la participación de la materia gris en la EM y la asociación entre el daño de la materia gris, la discapacidad física y el deterioro cognitivo. Por lo tanto, se necesitan biomarcadores que capturen de manera confiable los diferentes aspectos de la heterogeneidad de la enfermedad y podrían ayudar a comprender mejor la etiopatogenia, el diagnóstico y el pronóstico de la enfermedad de EM, para predecir el resultado de la respuesta a los tratamientos y para desarrollar nuevos tratamientos.

En particular, existe un esfuerzo cada vez mayor para desarrollar marcadores de diagnóstico molecular que cumplan requisitos como fácil accesibilidad, por ejemplo, de sangre, alta especificidad y sensibilidad, bajos costos y aplicabilidad por parte de laboratorios con equipo estándar. Se han propuesto varios biomarcadores de MS en sangre, plasma o suero para cumplir con estos criterios. En este orden, los marcadores circulantes están representados, además de los marcadores séricos clásicos, también por las células y por los ácidos nucleicos circulantes libres (ADN, ARN). En los últimos años, entre los ácidos nucleicos circulantes, ha surgido un posible papel del ADN mitocondrial como biomarcador en el diagnóstico de numerosas patologías.

En humanos, el ADNmt es significativamente más pequeño en comparación con el ADN nuclear (16.569 pb vs. 3.200 millones de pb), y posee solo 37 genes, entre los cuales 13 codifican proteínas pertenecientes a la cadena de transporte de electrones respiratorios. A diferencia del ADN nuclear, el ADNmt carece de histonas protectoras y de mecanismos sofisticados de reparación del ADN, lo que lo hace vulnerable a los estímulos genotóxicos, incluido el estrés oxidativo. De hecho, se generan altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) alrededor del mtDNA durante la fosforilación oxidativa que ocurre en las mitocondrias. Tal entorno oxidativo contribuye a una alta susceptibilidad del mtDNA a la mutagénesis. De hecho, el ADNmt posee aproximadamente una tasa de mutagénesis de 10 a 200 veces mayor que el ADN nuclear en un entorno de estrés oxidativo comparable. Esto puede ser perjudicial para aquellas células posmitóticas y que demandan mucha energía, incluidas las neuronas y los miocitos, que son en su mayoría sensibles a la actividad alterada de la cadena respiratoria y al daño mediado por ROS producido por cambios en el ADNmt. Tal vulnerabilidad específica del mtDNA determina la aparición de una cantidad detectable de fragmentos de ADN mitocondrial, que se liberan en el torrente sanguíneo como fragmentos libres de células circulantes (ccf-mtDNA). Estos corresponden a moléculas de ADN de doble cadena, que se fragmentan biológicamente en segmentos tanto cortos (menos de 1 Kb) como largos (hasta 21 kb). La alta tasa de fragmentación del mtDNA es clave en la generación de ccf-mtDNA, aunque no está claro si el mtDNA se libera debido a una alteración de la membrana plasmática o si se expulsa activamente de la célula. Por ejemplo, el estrés oxidativo u otros estímulos pueden dañar la integridad celular y producir apoptosis o necrosis, lo que a su vez conduce a la extrusión de ADNmt de la célula o su liberación a la sangre. No obstante, incluso en condiciones de referencia cuando la membrana plasmática está intacta, los fragmentos de ADNmt mutado podrían compartimentarse dentro de los orgánulos citosólicos y luego liberarse extracelularmente. Este último mecanismo garantizaría la preservación de la función mitocondrial mediante la eliminación de fragmentos de ADN mutados disfuncionales. Esto está respaldado por trabajos recientes de neuronas de C. elegans, que expulsan mitocondrias disfuncionales cuando se exponen a estrés neurotóxico. No obstante, el papel biológico de ccf-mtDNA y sus fragmentos sigue siendo controvertido y debe comprenderse por completo. De hecho, los fragmentos de ADN pueden actuar como moléculas tóxicas, que a su vez deterioran la función mitocondrial y la membrana celular, y también podrían actuar sobre la integridad celular y la reparación de tejidos. Esto está ligado en gran medida a la implicación establecida, aunque doble, del mtDNA en la inmunidad innata y la inflamación. De hecho, al igual que el ADN bacteriano, el mtDNA posee sitios CpG no metilados, que una vez liberados en el citosol o en el espacio extracelular se comportan como patrones moleculares asociados al daño (DAMP) para activar la inmunidad innata y la inflamación. Esto ocurre a través de cascadas bioquímicas específicas que implican la unión del mtDNA al receptor tipo Toll 9 (TLR9) y la posterior activación de la vía del estimulador de genes de interferón (STING). Estos son clave en la generación de respuestas inflamatorias, incluida la inmunidad antimicrobiana y los trastornos neuroinmunológicos. De hecho, la acumulación de DAMP activa los macrófagos residentes y favorece la infiltración de los tejidos por parte de los leucocitos. En cuanto a la mayoría de las moléculas implicadas en la respuesta inmunitaria, la mayor parte de la evidencia sobre la medición de ccf-mtDNA y su papel en la fisiología y la enfermedad proviene de estudios realizados fuera del SNC. De hecho, ccf-mtDNA se ha analizado en diversas condiciones clínicas como neoplasias, traumatismos, infecciones, accidentes cerebrovasculares y enfermedades cardiovasculares, donde se ha probado como biomarcador diagnóstico y predictivo. Recientemente, el mtDNA comenzó a evaluarse en trastornos neurológicos. De acuerdo con la mayor resistencia del mtDNA a la degradación dependiente de nucleasas en comparación con el nDNA, el mtDNA persiste como ccf-mtDNA dentro de los líquidos extracelulares, incluido el LCR.

Los trastornos del SNC que presentan una fuerte respuesta inflamatoria se caracterizan por niveles elevados de ADNmt en plasma. De hecho, se producen ccf-mtDNA elevados en LCR en pacientes con recaídas y remisiones (RRMS) y PMS. La EMRR se caracteriza por una respuesta inflamatoria aguda, que precede a la neurodegeneración. Por lo tanto, el aumento de ccf-mtDNA observado en RRMS es una consecuencia directa del aumento de la activación de las células inflamatorias. Estas células liberan mtDNA además de nDNA, en el LCR. Una reacción inflamatoria persistente puede reclutar células inmunitarias circulantes mientras desencadena una respuesta sistémica a través de la activación de vías inflamatorias inducidas por mtDNA. De esta manera, se produce un círculo vicioso en el que las citoquinas inflamatorias y las ROS pueden inducir más daño a las mitocondrias y al mtDNA. En este escenario, la concentración elevada de ccf-mtDNA en la EM puede reflejar una actividad inflamatoria activa temprana, que eventualmente culmina en daño mitocondrial, pérdida neural y atrofia cerebral. En esta condición, la medición de la concentración de ccf-mtDNA se configura como un biomarcador potencial para el estrés inflamatorio agudo. Aún debe investigarse si este fenómeno es específico de la EM o refleja una neuroinflamación genérica. Dado que el daño mitocondrial ocurre en las lesiones activas de la EM, el mtDNA en el LCR podría reflejar su papel como DAMP. Considerar el ADNmt como un DAMP en la EM puede explicar la "teoría de adentro hacia afuera" que sugiere que la inflamación es secundaria a un proceso intrínseco primario dentro de las neuronas u otras células, como los oligodendrocitos. Este concepto neuroinmune consiste en la formación de compuestos intracelulares, que desencadenan cascadas bioquímicas que conducen a la activación de la inmunidad (inflamasoma) que, una vez liberados de la célula, reclutan a su vez una respuesta inmunitaria focal. En este escenario, el fragmento de mtDNA "interior" sería el estímulo inflamatorio, que agrupa la cascada intracelular que conduce a un complejo molecular, que desencadena la respuesta inmune. Una vez que dicho complejo se expone "fuera" de la célula, la inmunidad se activa fuertemente.

Por lo tanto, ccf-mtDNA puede ser un biomarcador potencial de muerte celular y lesión tisular no específica y, en un futuro cercano, se supone que se convertirá en una herramienta de diagnóstico innovadora en la detección temprana y el pronóstico de varios trastornos.