Cibler les canaux potassiques pour reprogrammer le microenvironnement du glioblastome : études in vitro et in vivo

Objectif spécifique 1 :

Objectif spécifique 3 :

Déterminer si les microvésicules dérivées de M ou de Mf, délivrées au cerveau d'un gliome porteur de souris, pourraient affecter la croissance du gliome et la survie des souris. Cela permettra de mieux définir le rôle de M dans le contrôle de la croissance du gliome en fonction de son état d'activation et de l'expression et de l'activité des canaux KCa3.1 et Kv1.3. OBJECTIF : à partir de cet objectif, les chercheurs s'attendent à vérifier si la délivrance cérébrale de M polarisés différemment (ou de vésicules dérivées de M), ou de M/Mf, pourrait représenter une approche significative pour contrer la croissance du gliome et pour allonger la survie des souris.

Étudiez la relation entre les cellules CD11b + et NK lors de l'inhibition de KCa3.1 et Kv1.3 ou de l'épuisement des cellules NK. OBJECTIF : les données obtenues permettront de comprendre si l'état d'activation de M/Mf affecte l'accumulation de cellules NK dans le site tumoral et leur activité cytotoxique, si les cellules NK modulent l'activation de M/Mf, avec des effets sur la croissance tumorale, et le rôle éventuel joué par Canaux K+. Nos données préliminaires montrant que le traitement au TRAM-34 augmentait le niveau d'ARNm de l'IL-15 dans le cerveau des souris porteuses de gliome (FIG3) suggéreraient une accumulation accrue de cellules NK médiée par l'IL-15 dans la région tumorale, de la même manière que les preuves précédentes. (19).

Étudier les rôles des canaux KCa3.1 et Kv1.3 dans l'interaction entre le gliome et le parenchyme environnant. OBJECTIF : identifier d'éventuels mécanismes d'altération de la communication dans le cerveau de souris traitées avec des inhibiteurs du canal K+ en étudiant les courants K+, la transmission synaptique excitatrice et inhibitrice et l'état d'activation des astrocytes, dans des conditions normales et hypoxiques (correspondant à différentes positions dans la masse tumorale). L'expression et la fonction altérées des canaux ioniques dans les cellules de gliome isolées de souris traitées avec des vésicules dérivées de M et de M fonctionnellement différentes seront également étudiées.

Conception expérimentale Objectif 1 :

Conception expérimentale Objectif 2 :

Conception expérimentale Objectif 3 :

Cela sera étudié avec M polarisé en culture, traité avec TRAM-34 ou PAP-1, réduit au silence par des siARN spécifiques de KCa3.1 (9) ou isolé à partir de souris KCa3.1-/- ou Kv1.3 -/- et transplanté dans le cerveau de souris porteuses de gliome par injection cérébrale ou administration intranasale. L'injection cérébrale de M sera effectuée de la même manière que l'injection de gliome (21). L'application intranasale (i.n.) de cellules sera effectuée au cours d'une courte anesthésie à l'isoflurane. Avant le traitement, tous les animaux recevront 100 U de hyaluronidase i.n. dissous dans 12 µL de PBS stérile et une heure plus tard, une suspension de microglie (3 × 105 dans 12 µL de PBS stérile) ou un véhicule (PBS) sera appliqué en utilisant la même procédure. L'application de microglie sera répétée tous les 3 jours jusqu'au sacrifice des souris. Pour vérifier la livraison de M dans la région de la tumeur cérébrale, des expériences de contrôle seront réalisées à l'aide de M marqué GFP, obtenu à partir de souris sœurs CX3CR1GFP/+, déjà disponibles dans notre laboratoire. Pour préparer les micro-vésicules, M sera traité avec de l'ATP (1mM) pendant 30 min (20). Différentes étapes de centrifugation seront réalisées et l'homogénéité de dimension des vésicules sera évaluée dans des expériences parallèles par diffusion dynamique de la lumière. Des volumes fixes de cette préparation (4 microL) seront administrés par voie nasale tous les 3 jours jusqu'au sacrifice des souris. Les souris transplantées de micro-vésicules dérivées de M et Mf seront ensuite analysées pour le volume de la tumeur et la survie des souris étudiées comme décrit (9).

Celle-ci sera réalisée sur des cellules isolées (par biopsie humaine et cerveau de souris) par tri FACS ou par séparateur magnétique (cellules CD11b+), et testées in vitro pour l'activité phagocytaire et cytotoxique. Les chercheurs effectueront également des analyses de l'expression des gènes et des enregistrements électrophysiologiques (patch clamp) de la fonction des canaux ioniques sur M et sur des cellules tumorales in vitro et ex vivo dans des tranches de cerveau. Ces expériences seront réalisées chez des souris traitées avec TRAM-34 ou PAP-1 ou chez des souris portant un gliome KCa3.1-/- ou KV1.3-/-. L'interaction cellulaire M/Mf-NK sera également étudiée en examinant l'altération M/Mf induite par NK et l'altération NK induite par M/Mf. Dans ce but, les chercheurs épuiseront la population de cellules NK avec des injections répétées d'anticorps anti-NK1.1 chez des souris porteuses de gliome, afin d'analyser l'état d'activation de la population de cellules M/Mf.

Dans ce but, les chercheurs utiliseront l'analyse au microscope électrophysiologique, à fluorescence et confocale dans des préparations aiguës de tranches de cerveau. Une description détaillée du rôle fonctionnel des canaux K+ microgliaux dans la modulation de la progression du gliome sera fournie. En particulier, les propriétés fonctionnelles des canaux KCa3.1 et Kv1.3 exprimés par les cellules microgliales chez les souris témoins et injectées dans le gliome seront évaluées dans des tranches de cerveau aiguës au moyen des techniques de patch-clamp. Les effets du blocage des canaux K sur la signalisation neuronale et sur la réactivité des astrocytes seront également évalués dans les mêmes conditions. L'imagerie Ca2+ numérique basée sur la fluorescence sera utilisée pour évaluer le rôle de ces canaux dans la régulation microgliale [Ca2+]i. En utilisant des mesures électrophysiologiques, en combinaison avec des analyses immunochimiques, PCR, siRNA, les chercheurs analyseront également la modulation des canaux K dans le gliome. À l'aide de tranches de cerveau aigu de souris ayant reçu une injection de gliome, les chercheurs évalueront également si le traitement des souris avec du M polarisé affecte l'expression et la fonction des canaux ioniques du gliome connus pour contribuer au phénotype transformé, tels que les canaux KCa3.1, les canaux BK et canaux Cl activés par le volume. Ces expériences seront réalisées dans des zones hypoxiques et non hypoxiques de la tumeur, identifiées ex post en évaluant l'expression de HIF-1alfa.

Méthodologies et analyses statistiques : La méthode itérative de « Camussi et al. (20) seront suivies. Les enquêteurs utiliseront la relation suivante où n est le nombre d'animaux : n>2sigma^2 (z alpha/D)^2. A titre d'exemple, pour estimer le nombre de souris nécessaires pour obtenir une significativité alpha = 0,09, une différence D d'effet du traitement sur un paramètre donné, les investigateurs ont besoin de connaître l'écart type sigma. Étant donné que sigma^2 est inconnu, il doit être remplacé par une estimation de la variance d'échantillonnage s^2. Si les enquêteurs donnent à s ^ 2 = 0,01, les enquêteurs ont ce n> 18, donc les enquêteurs prévoient d'utiliser 20 souris par groupe expérimental. Notre expérience avec les souris suggère qu'il s'agit d'un nombre raisonnable. La signification statistique sera évaluée par une ANOVA unidirectionnelle pour les données paramétriques, comme indiqué ; Le test "Holm-Sidak" sera utilisé comme test post-hoc ; Test de "Mann et Withney" pour les données non paramétriques. Le cas échéant, le test t de Student ou l'analyse de la variance (ANOVA) sera utilisé.