Målretting av kaliumkanaler for å omprogrammere glioblastommikromiljø: in vitro og in vivo studier

Spesifikt mål 1:

Spesifikt mål 3:

For å undersøke om M, eller Mf-avledede mikrovesikler, levert til hjernen til mus som bærer gliom kan påvirke gliomvekst og musoverlevelse. Dette vil tillate å bedre definere rollen til M i å kontrollere gliomvekst som en funksjon av dens aktiveringstilstand og av KCa3.1- og Kv1.3-kanaluttrykk og aktivitet. MÅL: Fra dette målet forventer etterforskerne å verifisere om hjernelevering av forskjellig polariserte M (eller M-avledede vesikler), eller M/Mf, kan representere en meningsfull tilnærming for å motvirke gliomvekst og forlenge musenes overlevelse.

Undersøk forholdet mellom CD11b+ og NK celler ved KCa3.1 og Kv1.3 hemming eller NK celle utarming. MÅL: data innhentet vil bidra til å forstå om aktiveringstilstanden til M/Mf påvirker NK-celleakkumulering i tumorstedet og deres cytotoksiske aktivitet, om NK-celler modulerer M/Mf-aktivering, med effekter på tumorvekst, og den eventuelle rollen som spilles av K+ kanaler. Våre foreløpige data som viser at TRAM-34-behandling økte mRNA-nivået av IL-15 i hjernen til gliombærende mus (FIG3) ville foreslå en IL-15-mediert økt akkumulering av NK-celler i tumorregionen, på samme måte som tidligere bevis (19).

Å undersøke rollene til KCa3.1 og Kv1.3 kanaler i samspillet mellom gliom og det omkringliggende parenkymet. MÅL: å identifisere mulige mekanismer for endret kommunikasjon i hjernen til mus behandlet med K+-kanalhemmere ved å studere K+-strømmer, eksitatorisk og hemmende synaptisk overføring og astrocytters aktiveringstilstand, under normale og hypoksiske forhold (tilsvarende forskjellig posisjon i tumormassen). Endret uttrykk og funksjon av ionekanaler i gliomceller isolert fra mus behandlet med funksjonelt forskjellige M- og M-avledede vesikler vil også bli undersøkt.

Eksperimentell design mål 1:

Eksperimentell designmål 2:

Eksperimentell designmål 3:

Dette vil bli undersøkt med M polarisert i kultur, behandlet med TRAM-34 eller PAP-1, dempet av siRNA spesifikt for KCa3.1 (9) eller isolert fra KCa3.1-/- eller Kv1.3 -/- mus og transplantert i hjernen til gliombærende mus ved hjerneinjeksjon eller intranasal levering. Hjerneinjeksjon av M vil bli utført på samme måte som gliominjeksjon (21). Intranasal (i.n.) cellepåføring vil bli utført under en kort isoflurananestesi. Før behandling vil alle dyr få 100 U hyaluronidase i.n. oppløst i 12 µL steril PBS og en time senere vil en mikroglia-suspensjon (3 × 105 i 12 µL steril PBS) eller bærer (PBS) påføres med samme prosedyre. Microglia-påføring vil bli gjentatt hver 3. dag inntil musene ofres. For å sjekke for M-levering i hjernesvulstregionen, vil kontrolleksperimenter bli utført med GFP-merket M, hentet fra søsken CX3CR1GFP/+ mus, allerede tilgjengelig i vårt laboratorium. For å forberede mikrovesikler vil M bli behandlet med ATP (1mM) i 30 min (20). Ulike sentrifugeringstrinn vil bli utført og homogeniteten til vesikkeldimensjonen vil bli evaluert i parallelle eksperimenter ved dynamisk lysspredning. Faste volumer av dette preparatet (4 mikroL) vil bli administrert intranasalt hver 3. dag inntil musene ofres. M- og Mf-avledede mikrovesikkel-transplanterte mus vil deretter bli analysert for tumorvolum og musenes overlevelse undersøkt som beskrevet (9).

Dette vil bli utført på celler isolert (ved human biopsi og musehjerne) ved FACS-sortering eller ved magnetisk separator (CD11b+-celler), og analysert in vitro for fagocytisk og cytotoksisk aktivitet. Etterforskerne vil også utføre analyse av genuttrykk og elektrofysiologiske registreringer (patch clamp) av ionekanalfunksjon på M og på tumorceller in vitro og ex vivo i hjerneskiver. Disse eksperimentene vil bli utført i TRAM-34- eller PAP-1-behandlede eller i KCa3.1-/- eller KV1.3-/- gliombærende mus. M/Mf-NK-celleinteraksjon vil også bli studert og ser på NK-indusert M/Mf-endring og M/Mf-indusert NK-endring. Med dette målet vil etterforskerne tømme NK-cellepopulasjonen med gjentatt injeksjon av anti-NK1.1-antistoff i gliombærende mus, for å analysere aktiveringstilstanden til M/Mf-cellepopulasjonen.

For dette formålet vil etterforskerne bruke elektrofysiologisk, fluorescens og konfokal mikroskopanalyse i akutte hjerneskivepreparater. En detaljert beskrivelse av den funksjonelle rollen til mikrogliale K+-kanaler i modulerende gliomprogresjon vil bli gitt. Spesielt vil de funksjonelle egenskapene til KCa3.1- og Kv1.3-kanaler uttrykt av mikrogliaceller i kontroll- og gliominjiserte mus bli evaluert i akutte hjerneskiver ved hjelp av patch-clamp-teknikker. Effektene av K-kanalblokkering på nevronal signalering og på astrocytters reaktivitet vil også bli evaluert under de samme forholdene. Fluorescensbasert digital Ca2+-avbildning vil bli brukt for å vurdere rollen til disse kanalene i mikroglial [Ca2+]i-regulering. Ved hjelp av elektrofysiologiske målinger, i kombinasjon med immunkjemisk, PCR, siRNA-analyse, vil etterforskerne også analysere moduleringen av K-kanaler i gliom. Ved å bruke akutte hjerneskiver fra gliominjiserte mus, vil etterforskerne også vurdere om behandling av mus med polarisert M påvirker uttrykket og funksjonen til gliomionekanaler som er kjent for å bidra til den transformerte fenotypen, slik som KCa3.1-kanaler, BK-kanaler og volumaktiverte Cl-kanaler. Disse eksperimentene vil bli utført i hypoksiske og ikke-hypoksiske områder av svulsten, identifisert ex post ved å evaluere HIF-1alfa-ekspresjonen.

Metoder og statistiske analyser: Den iterative metoden til "Camussi et al." (20) vil bli fulgt. Etterforskerne vil bruke følgende relasjon der n er antall dyr: n>2sigma^2 (z alfa/D)^2. Som et eksempel, for å estimere antall mus som er nødvendig for å oppnå en signifikans alfa=0,09, en forskjell D i behandlingseffekt på en gitt parameter, må etterforskerne kjenne standardavviket sigma. Siden sigma^2 er ukjent, må den erstattes med et estimat av samplingsvarians s^2. Hvis etterforskerne gir til s^2=0,01, har etterforskerne det n>18, så etterforskerne spår å bruke 20 mus per eksperimentell gruppe. Vår erfaring med mus tilsier at det er et rimelig antall. Statistisk signifikans vil bli vurdert ved enveis ANOVA for parametriske data, som angitt; "Holm-Sidak" test vil bli brukt som post-hoc test; "Mann and Withney"-test for ikke-parametriske data. Der det er hensiktsmessig, vil studentens t-test eller variansanalyse (ANOVA) bli brukt.