교모세포종 미세 환경을 재프로그래밍하기 위한 칼륨 채널 표적화: 시험관 내 및 생체 내 연구

특정 목표 1:

구체적인 목표 3:

신경아교종을 지닌 마우스의 뇌에 전달된 M 또는 Mf 유래 미세소포가 신경교종 성장 및 마우스 생존에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사하기 위해. 이를 통해 활성화 상태와 KCa3.1 및 Kv1.3 채널 발현 및 활동의 함수로서 신경아교종 성장을 제어하는 ​​M의 역할을 더 잘 정의할 수 있습니다. 목표: 이 목표에서 연구자들은 다르게 극성화된 M(또는 M-유래 소포) 또는 M/Mf의 뇌 전달이 신경아교종 성장을 막고 생쥐의 생존을 연장하는 의미 있는 접근법을 나타낼 수 있는지 여부를 검증할 것으로 기대합니다.

KCa3.1 및 Kv1.3 억제 또는 NK 세포 고갈 시 CD11b+와 NK 세포 간의 관계를 조사합니다. 목적: 얻은 데이터는 M/Mf의 활성화 상태가 종양 부위의 NK 세포 축적 및 세포독성 활성에 영향을 미치는지 여부, NK 세포가 M/Mf 활성화를 조절하는지 여부, 종양 성장에 미치는 영향 및 궁극적인 역할을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. K+ 채널. TRAM-34 치료가 신경아교종 보유 마우스의 뇌에서 IL-15의 mRNA 수준을 증가시킨다는 것을 보여주는 우리의 예비 데이터(도 3)는 이전 증거와 유사하게 종양 영역에서 IL-15 매개된 NK 세포의 증가된 축적을 제안할 것입니다 (19).

신경아교종과 주변 실질 조직 사이의 상호 작용에서 KCa3.1 및 Kv1.3 채널의 역할을 조사합니다. 목표: 정상 및 저산소 상태(종양 덩어리의 다른 위치에 해당)에서 K+ 전류, 흥분성 및 억제성 시냅스 전달 및 성상세포 활성화 상태를 연구하여 K+ 채널 억제제로 치료한 마우스의 뇌에서 변경된 통신의 가능한 메커니즘을 식별합니다. 기능적으로 다른 M 및 M-유래 소포로 처리된 마우스로부터 분리된 신경아교종 세포에서 이온 채널의 변경된 발현 및 기능도 조사될 것이다.

실험 설계 목표 1:

실험 설계 목표 2:

실험 설계 목표 3:

이것은 배양에서 M 극성화, TRAM-34 또는 PAP-1로 처리, KCa3.1에 특이적인 siRNA에 의해 침묵화(9) 또는 KCa3.1-/- 또는 Kv1.3 -/- 마우스로부터 분리되고 이식된 M으로 조사될 것이다. 뇌 주사 또는 비강 전달에 의해 신경아교종 보유 마우스의 뇌에서. M의 뇌 주입은 신경교종 주입과 유사하게 수행될 것이다(21). 비강내(i.n.) 세포 적용은 짧은 이소플루란 마취 동안 수행됩니다. 치료 전에 모든 동물은 100U 히알루로니다제를 i.n. 12 μL의 멸균 PBS에 용해하고 1시간 후 마이크로글리아 현탁액(멸균 PBS 12 μL에서 3 x 105) 또는 비히클(PBS)을 동일한 절차를 사용하여 적용합니다. Microglia 적용은 마우스가 희생될 때까지 3일마다 반복됩니다. 뇌종양 영역에서 M 전달을 확인하기 위해 실험실에서 이미 사용 가능한 형제 CX3CR1GFP/+ 마우스에서 얻은 GFP 표지 M을 사용하여 제어 실험을 수행합니다. 미세 소포를 준비하기 위해 M은 30분 동안 ATP(1mM)로 처리됩니다(20). 다른 원심 분리 단계가 수행되고 소포 크기의 균질성이 동적 광산란에 의한 병렬 실험에서 평가됩니다. 이 제제의 고정된 부피(4microL)는 마우스가 희생될 때까지 3일마다 비강으로 투여될 것입니다. M 및 Mf 유래 미세소포 이식 마우스는 종양 부피 및 마우스 생존에 대해 설명된 바와 같이 분석될 것이다(9).

이것은 FACS 분류 또는 자기 분리기(CD11b+ 세포)에 의해 분리된 세포(인간 생검 및 마우스 뇌에 의해)에서 수행되고 식세포 및 세포독성 활성에 대해 시험관 내에서 분석될 것입니다. 조사관은 또한 뇌 절편에서 시험관 내 및 생체 외에서 M 및 종양 세포에 대한 이온 채널 기능의 유전자 발현 및 전기생리학적 기록(패치 클램프) 분석을 수행할 것입니다. 이들 실험은 TRAM-34 또는 PAP-1 처리된 마우스 또는 KCa3.1-/- 또는 KV1.3-/- 신경아교종 보유 마우스에서 수행될 것이다. M/Mf-NK 세포 상호작용은 또한 NK-유도 M/Mf 변경 및 M/Mf-유도 NK 변경을 관찰하면서 연구될 것이다. 이 목표에서 조사관은 M/Mf 세포 집단의 활성화 상태를 분석하기 위해 신경아교종 보유 마우스에 항 NK1.1 항체를 반복적으로 주입하여 NK 세포 집단을 고갈시킬 것입니다.

이 목적을 위해 연구자들은 급성 뇌 절편 준비에서 전기생리학, 형광 및 공초점 현미경 분석을 사용할 것입니다. 신경아교종 진행 조절에 있어 미세아교세포 K+ 채널의 기능적 역할에 대한 자세한 설명이 제공될 것입니다. 특히, 대조군 및 신경아교종 주사 마우스에서 미세아교세포에 의해 발현되는 KCa3.1 및 Kv1.3 채널의 기능적 특성은 패치-클램프 기술을 통해 급성 뇌 절편에서 평가될 것이다. 신경 신호 및 성상 세포 반응성에 대한 K 채널 차단의 효과도 동일한 조건에서 평가됩니다. 형광 기반 디지털 Ca2+ 이미징은 미세아교세포 [Ca2+]i 조절에서 이러한 채널의 역할을 평가하는 데 사용됩니다. 연구자들은 면역화학, PCR, siRNA 분석과 함께 전기생리학적 측정을 사용하여 신경아교종에서 K 채널의 변조도 분석할 것입니다. 신경아교종이 주입된 마우스의 급성 뇌 절편을 사용하여 연구자들은 극성화된 M으로 마우스를 치료하는 것이 KCa3.1 채널, BK 채널 및 볼륨 활성화 Cl 채널. 이러한 실험은 사후에 HIF-1alfa 발현을 평가하여 확인된 종양의 저산소 및 비저산소 영역에서 수행됩니다.

방법론 및 통계적 분석: "Camussi et al."의 반복적 방법. (20)이 이어집니다. 조사자는 n이 동물의 수인 다음 관계를 사용합니다: n>2sigma^2 (z alpha/D)^2. 예를 들어, 유의성 알파=0.09, 주어진 매개변수에 대한 치료 효과의 차이 D를 얻는 데 필요한 마우스 수를 추정하기 위해 조사자는 표준 편차 시그마를 알아야 합니다. sigma^2는 알 수 없으므로 샘플링 분산 추정치 s^2로 대체해야 합니다. 조사자가 s^2=0.01로 제공하면 조사자는 n>18이므로 조사자는 실험 그룹당 20마리의 마우스를 사용할 것으로 예측합니다. 생쥐에 대한 우리의 경험은 그것이 합리적인 숫자임을 시사합니다. 통계적 유의성은 표시된 바와 같이 파라메트릭 데이터에 대한 일원 분산 분석에 의해 평가됩니다. "Holm-Sidak" 테스트는 사후 테스트로 사용됩니다. 비모수 데이터에 대한 "Mann and Withney" 테스트. 적절한 경우 스튜던트 t-테스트 또는 분산 분석(ANOVA)이 사용됩니다.