A káliumcsatornák megcélzása a glioblasztóma mikrokörnyezet újraprogramozására: in vitro és in vivo vizsgálatok

1. konkrét cél:

3. konkrét cél:

Annak vizsgálata, hogy a gliómát hordozó egér agyába szállított M vagy Mf eredetű mikrovezikulák befolyásolhatják-e a glióma növekedését és az egerek túlélését. Ez lehetővé teszi az M szerepének pontosabb meghatározását a glióma növekedésének szabályozásában az aktiválási állapota, valamint a KCa3.1 és Kv1.3 csatorna expressziója és aktivitása függvényében. CÉLKITŰZÉS: ebből a célból a kutatók azt várják, hogy ellenőrizzék, vajon a különböző polaritású M (vagy M-eredetű vezikulák) vagy M/Mf agybejuttatása értelmes megközelítést jelenthet-e a glióma növekedésének ellensúlyozására és az egerek túlélésének meghosszabbítására.

Vizsgálja meg a CD11b+ és az NK sejtek közötti kapcsolatot KCa3.1 és Kv1.3 gátlás vagy NK sejt depléció esetén. CÉLKITŰZÉS: a kapott adatok segítenek megérteni, hogy az M/Mf aktivációs állapota befolyásolja-e az NK-sejtek felhalmozódását a tumor helyén és azok citotoxikus aktivitását, hogy az NK-sejtek modulálják-e az M/Mf-aktivációt, ami hatással van a tumor növekedésére, valamint a K+ csatornák. Előzetes adataink, amelyek azt mutatják, hogy a TRAM-34 kezelés megnövelte az IL-15 mRNS szintjét gliomát hordozó egerek agyában (3. ábra), az IL-15 által közvetített fokozott NK-sejtek felhalmozódására utalnak a daganatos régióban, hasonlóan a korábbi bizonyítékokhoz. (19).

A KCa3.1 és Kv1.3 csatornák szerepének vizsgálata a glióma és a környező parenchyma közötti kölcsönhatásban. CÉLKITŰZÉS: a K+-csatorna-inhibitorokkal kezelt egerek agyában a megváltozott kommunikáció lehetséges mechanizmusainak azonosítása a K+-áramok, a serkentő és gátló szinaptikus transzmisszió, valamint az asztrociták aktivációs állapotának vizsgálatával, normál és hipoxiás körülmények között (amely a tumortömeg eltérő pozíciójának felel meg). A funkcionálisan eltérő M- és M-eredetű vezikulákkal kezelt egerekből izolált gliómasejtek megváltozott expresszióját és ioncsatornáinak működését is megvizsgáljuk.

Kísérleti tervezés 1. cél:

Kísérleti tervezés 2. cél:

Kísérleti tervezés 3. cél:

Ezt tenyészetben polarizált M-vel, TRAM-34-gyel vagy PAP-1-gyel kezelt, KCa3.1-re specifikus siRNS-sel elhallgattatva (9) vagy KCa3.1-/- vagy Kv1.3 -/- egerekből izolált és transzplantált M-vel vizsgáljuk. gliomát hordozó egerek agyában agyi injekcióval vagy intranazális bejuttatással. Az M agyi injekciója a glióma injekcióhoz hasonlóan történik (21). Az intranazális (i.n.) sejtalkalmazás egy rövid izoflurán érzéstelenítés során történik. A kezelés előtt minden állat 100 E hialuronidázt kap i.n. 12 µl steril PBS-ben oldva, majd egy órával később mikroglia szuszpenziót (3 × 105 12 µl steril PBS-ben) vagy vivőanyagot (PBS) alkalmazunk ugyanezzel az eljárással. A Microglia alkalmazását 3 naponta megismételjük az egerek elpusztításáig. Az agydaganat régióban történő M bejuttatásának ellenőrzésére a kontrollkísérleteket a laboratóriumunkban már elérhető, GFP-vel jelölt M-vel végezzük, amely CX3CR1GFP/+ testvéregerekből származik. A mikrovezikulák elkészítéséhez M-et ATP-vel (1 mM) kezeljük 30 percig (20). Különböző centrifugálási lépéseket hajtunk végre, és párhuzamos kísérletekben dinamikus fényszórás segítségével értékeljük a vezikulum méretének homogenitását. Ennek a készítménynek a rögzített térfogatait (4 mikroliter) intranazálisan adjuk be 3 naponta az egerek leöléséig. Az M- és Mf-eredetű mikro-vezikula-transzplantált egereket ezután a tumor térfogatára és az egerek túlélésére vonatkozó vizsgálatnak vetjük alá (9).

Ezt FACS-válogatással vagy mágneses szeparátorral (CD11b+ sejtek) izolált sejteken (humán biopsziával és egéragyval) fogják elvégezni, és in vitro megvizsgálják a fagocita és citotoxikus aktivitást. A kutatók a génexpresszió elemzését és az ioncsatorna funkció elektrofiziológiai felvételeit (patch clamp) is elvégzik M-en és daganatsejteken in vitro és ex vivo agyszeletekben. Ezeket a kísérleteket TRAM-34-gyel vagy PAP-1-gyel kezelt, vagy KCa3.1-/- vagy KV1.3-/- gliomát hordozó egereken végezzük. Az M/Mf-NK sejt kölcsönhatást is tanulmányozzuk, megvizsgálva az NK által kiváltott M/Mf változást és az M/Mf által kiváltott NK változást. Ennek érdekében a kutatók az NK-sejtpopulációt kimerítik az anti-NK1.1 antitest ismételt injekciójával gliómát hordozó egerekben, hogy elemezzék az M/Mf sejtpopuláció aktiválási állapotát.

Ebből a célból a kutatók elektrofiziológiai, fluoreszcens és konfokális mikroszkópos analízist alkalmaznak az akut agyszelet preparátumokban. Részletes leírást adunk a mikroglia K+ csatornák funkcionális szerepéről a glióma progressziójának modulálásában. Pontosabban, a mikrogliasejtek által expresszált KCa3.1 és Kv1.3 csatornák funkcionális tulajdonságait a kontroll és gliómával injektált egerekben értékeljük akut agyszeletekben a patch-clamp technikák segítségével. Ugyanilyen körülmények között értékeljük a K-csatorna blokád hatásait a neuronális jelátvitelre és az asztrociták reaktivitására. Fluoreszcencia alapú digitális Ca2+ képalkotást alkalmazunk ezen csatornák mikroglia [Ca2+]i szabályozásában betöltött szerepének felmérésére. Elektrofiziológiai mérésekkel, immunkémiai, PCR, siRNS analízissel kombinálva a kutatók a K csatornák modulációját is elemzik gliomában. A gliomával injekciózott egerek akut agyszeleteinek felhasználásával a kutatók azt is felmérik, hogy az egerek polarizált M-kezelése befolyásolja-e a glióma ioncsatornáinak expresszióját és működését, amelyekről ismert, hogy hozzájárulnak az átalakult fenotípushoz, mint például a KCa3.1 csatornák, BK csatornák és hangerő-aktivált Cl csatornák. Ezeket a kísérleteket a tumor hipoxiás és nem hipoxiás területein hajtják végre, amelyeket utólag azonosítottak a HIF-1alfa expressziójának értékelésével.

Módszertanok és statisztikai elemzések: A "Camussi et al." iteratív módszere. (20) követni fogják. A vizsgálók a következő összefüggést használják, ahol n az állatok száma: n>2sigma^2 (z alfa/D)^2. Példaként, az alfa=0,09 szignifikancia eléréséhez szükséges egerek számának becsléséhez, a kezelési hatás D különbségéhez egy adott paraméterre, a vizsgálóknak ismerniük kell a szórás szigmát. Mivel a szigma^2 ismeretlen, helyettesíteni kell az s^2 mintavételi variancia becslésével. Ha a kutatók s^2=0,01-et adnak meg, akkor a kutatók n>18 értékkel rendelkeznek, tehát a kutatók kísérleti csoportonként 20 egeret jósolnak. Az egerekkel kapcsolatos tapasztalataink azt mutatják, hogy ez ésszerű szám. A statisztikai szignifikanciát egyirányú ANOVA-val kell értékelni a paraméteres adatokra, a jelzett módon; A "Holm-Sidak" tesztet post-hoc tesztként használják; "Mann és Withney" teszt a nem paraméteres adatokhoz. Adott esetben Student-féle t-próbát vagy varianciaanalízist (ANOVA) kell alkalmazni.