Målretning af kaliumkanaler for at omprogrammere glioblastom mikromiljø: in vitro og in vivo undersøgelser

Specifikt mål 1:

Specifikt mål 3:

For at undersøge, om M, eller Mf-afledte mikrovesikler, leveret til hjernen af ​​musebærende gliomer kunne påvirke gliomvækst og muses overlevelse. Dette vil gøre det muligt bedre at definere M's rolle i at kontrollere gliomvækst som en funktion af dets aktiveringstilstand og af KCa3.1- og Kv1.3-kanalekspression og aktivitet. MÅL: Ud fra dette mål forventer efterforskerne at verificere, om hjernelevering af forskelligt polariserede M (eller M-afledte vesikler) eller M/Mf kunne repræsentere en meningsfuld tilgang til at modvirke gliomvækst og forlænge muses overlevelse.

Undersøg forholdet mellem CD11b+ og NK celler efter KCa3.1 og Kv1.3 hæmning eller NK celle udtømning. MÅL: opnåede data vil hjælpe med at forstå, om aktiveringstilstanden af ​​M/Mf påvirker NK-celleakkumulering i tumorstedet og deres cytotoksiske aktivitet, om NK-celler modulerer M/Mf-aktivering, med effekter på tumorvækst, og den eventuelle rolle, der spilles af K+ kanaler. Vores foreløbige data, der viser, at TRAM-34-behandling øgede mRNA-niveauet af IL-15 i hjernen hos gliombærende mus (FIG3), tyder på en IL-15-medieret øget akkumulering af NK-celler i tumorregionen, i lighed med tidligere beviser (19).

At undersøge rollerne af KCa3.1 og Kv1.3 kanaler i interaktionen mellem gliom og det omgivende parenkym. MÅL: at identificere mulige mekanismer for ændret kommunikation i hjernen hos mus behandlet med K+-kanalhæmmere ved at studere K+-strømme, excitatorisk og hæmmende synaptisk transmission og astrocytters aktiveringstilstand under normale og hypoxiske forhold (svarende til forskellig position i tumormassen). Ændret ekspression og funktion af ionkanaler i gliomceller isoleret fra mus behandlet med funktionelt forskellige M- og M-afledte vesikler vil også blive undersøgt.

Eksperimentelt designmål 1:

Eksperimentelt designmål 2:

Eksperimentelt designmål 3:

Dette vil blive undersøgt med M polariseret i kultur, behandlet med TRAM-34 eller PAP-1, dæmpet af siRNA specifikt for KCa3.1 (9) eller isoleret fra KCa3.1-/- eller Kv1.3 -/- mus og transplanteret i hjernen hos gliombærende mus ved hjerneinjektion eller intranasal levering. Hjerneinjektion af M vil blive udført på samme måde som gliominjektion (21). Intranasal (i.n.) cellepåføring vil blive udført under en kort isofluranæstesi. Før behandling vil alle dyr modtage 100 U hyaluronidase i.n. opløst i 12 µL steril PBS og en time senere påføres en mikrogliasuspension (3 × 105 i 12 µL steril PBS) eller vehikel (PBS) ved hjælp af samme procedure. Microglia påføring vil blive gentaget hver 3. dag, indtil musene ofres. For at kontrollere for M levering i hjernetumorregionen vil kontroleksperimenter blive udført ved hjælp af GFP-mærket M, opnået fra søskende CX3CR1GFP/+ mus, der allerede er tilgængelige i vores laboratorium. For at fremstille mikrovesikler vil M blive behandlet med ATP (1 mM) i 30 minutter (20). Forskellige centrifugeringstrin vil blive udført, og homogeniteten af ​​vesikeldimensionen vil blive evalueret i parallelle eksperimenter ved dynamisk lysspredning. Faste mængder af dette præparat (4 mikroL) vil blive administreret intranasalt hver 3. dag, indtil musene ofres. M- og Mf-afledte mikro-vesikel-transplanterede mus vil derefter blive analyseret for tumorvolumen og musenes overlevelse undersøgt som beskrevet (9).

Dette vil blive udført på celler isoleret (ved human biopsi og musehjerne) ved FACS-sortering eller ved magnetisk separator (CD11b+ celler) og analyseret in vitro for fagocytisk og cytotoksisk aktivitet. Efterforskerne vil også udføre analyse af genekspression og elektrofysiologiske registreringer (patch clamp) af ionkanalfunktion på M og på tumorceller in vitro og ex vivo i hjerneskiver. Disse eksperimenter vil blive udført i TRAM-34 eller PAP-1 behandlede eller i KCa3.1-/- eller KV1.3-/- gliombærende mus. M/Mf-NK-celleinteraktion vil også blive undersøgt med henblik på NK-induceret M/Mf-ændring og M/Mf-induceret NK-ændring. Med dette formål vil efterforskerne udtømme NK-cellepopulationen med gentagen injektion af anti-NK1.1-antistof i gliombærende mus for at analysere aktiveringstilstanden af ​​M/Mf-cellepopulationen.

Til dette formål vil efterforskerne bruge elektrofysiologisk, fluorescens og konfokal mikroskopanalyse i akutte hjerneskivepræparater. En detaljeret beskrivelse af den funktionelle rolle af mikrogliale K+-kanaler i modulering af gliomprogression vil blive givet. Især vil de funktionelle egenskaber af KCa3.1- og Kv1.3-kanaler udtrykt af mikrogliaceller i kontrol- og gliominjicerede mus blive evalueret i akutte hjerneskiver ved hjælp af patch-clamp-teknikkerne. Virkningerne af K-kanalblokade på neuronal signalering og på astrocytters reaktivitet vil også blive evalueret under de samme forhold. Fluorescens-baseret digital Ca2+ billeddannelse vil blive brugt til at vurdere disse kanalers rolle i mikroglial [Ca2+]i regulering. Ved hjælp af elektrofysiologiske målinger, i kombination med immunkemisk, PCR, siRNA-analyse, vil efterforskerne også analysere moduleringen af ​​K-kanaler i gliom. Ved hjælp af akutte hjerneskiver fra gliom-injicerede mus vil efterforskerne også vurdere, om behandling af mus med polariseret M påvirker ekspressionen og funktionen af ​​gliomionkanaler, der vides at bidrage til den transformerede fænotype, såsom KCa3.1-kanaler, BK-kanaler og volumenaktiverede Cl-kanaler. Disse eksperimenter vil blive udført i hypoxiske og ikke-hypoksiske områder af tumoren, identificeret ex post ved at evaluere HIF-1alfa-ekspressionen.

Metoder og statistiske analyser: Den iterative metode af "Camussi et al." (20) vil blive fulgt. Efterforskerne vil bruge følgende relation, hvor n er antallet af dyr: n>2sigma^2 (z alfa/D)^2. Som et eksempel, for at estimere antallet af mus, der er nødvendige for at opnå en signifikans alfa=0,09, en forskel D i behandlingseffekt på en given parameter, skal efterforskerne kende standardafvigelsen sigma. Da sigma^2 er ukendt, skal den erstattes med et estimat af samplingvarians s^2. Hvis efterforskerne giver til s^2=0,01, har efterforskerne det n>18, så efterforskerne forudsiger at bruge 20 mus pr. forsøgsgruppe. Vores erfaring med mus tyder på, at det er et rimeligt antal. Statistisk signifikans vil blive vurderet ved envejs ANOVA for parametriske data, som angivet; "Holm-Sidak" test vil blive brugt som post-hoc test; "Mann and Withney" test for ikke-parametriske data. Hvor det er relevant, vil Elevens t-test eller variansanalyse (ANOVA) blive brugt.