Caractérisation de la population de spermatozoïdes après différentes procédures de sélection (CROSP)

Différentes procédures sont actuellement disponibles pour sélectionner la population de sperme qui sera utilisée pour inséminer les ovocytes lors de la Procréation Médicale Assistée (MAR). La population sélectionnée doit contenir des spermatozoïdes entièrement fonctionnels qui possèdent la capacité d'atteindre le site de fécondation et de permettre une fécondation et un développement embryonnaire optimaux. Ces capacités dépendent strictement des caractéristiques morpho-fonctionnelles spécifiques des spermatozoïdes telles que, mais sans s'y limiter, la motilité, les anomalies morphologiques, le statut apoptotique [translocation de la phosphatidylsérine (stades précoces de l'apoptose)] et la fragmentation de l'ADN (stades ultérieurs de l'apoptose), La présente étude vise à déterminer laquelle des techniques de sélection de spermatozoïdes utilisées dans notre laboratoire de FIV conduit à la sélection de la meilleure population de spermatozoïdes en bonne santé en fonction de leurs paramètres morpho-fonctionnels. À cette fin, le sperme brut non utilisé après analyse diagnostique de routine sera divisé en 3 fractions et sera traité immédiatement par différentes méthodes de préparation du sperme : 1) DGC, 2) DGC et MACS, et 3) MSS.

Les spermatozoïdes sélectionnés par chaque méthode seront analysés pour les paramètres morphologiques et fonctionnels.

La concentration initiale de spermatozoïdes (×106/ml) sera évaluée à l'aide d'une chambre de comptage.

La motilité des spermatozoïdes sera évaluée sur 200 spermatozoïdes sous des grossissements 40× et les résultats seront exprimés en pourcentages.

Après chaque procédure de sélection, la concentration et la motilité seront déterminées à l'aide d'une chambre de comptage Neubauer.

Les spermatozoïdes de morphologie normale seront contrôlés sur frottis colorés par Diff Quick Staining sur frottis séchés, 200 spermatozoïdes seront classés normaux/anormaux selon les critères stricts de Kruger.

Translocation de la phosphatidylsérine (PS) (marqueur apoptotique précoce) : sera analysée par microscopie à fluorescence après incubation de la suspension de spermatozoïdes avec l'annexine V-FITC (isothiocyanate de fluorescéine) et l'iodure de propidium (PI). Les spermatozoïdes seront classés en : spermatozoïdes viables sans translocation PS (PI négatif/Annexine négatif) ; viable avec PS transloqué (PI négatif/Annexine positif) ; morts (PI positif/Annexine positif ou PI positif/Annexine négatif).

L'indice de fragmentation de l'ADN (pourcentage de spermatozoïdes présentant une fragmentation de l'ADN par nombre de cellules analysées ; DFI) sera analysé à l'aide du protocole d'essai TUNEL (terminal deoxynucleotidyl-transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-fluorescein nick end labeling) (kit disponible dans le commerce "In Situ Cell Death Détection" ; Roche Diagnostic). Le clivage de l'ADN génomique au cours de l'apoptose conduit à la fois à des cassures simple brin (entailles) et à des fragments d'ADN double brin de faible poids moléculaire. Ces cassures de brins d'ADN peuvent être identifiées dans une réaction enzymatique en deux étapes : (1) marquage des cassures de brins d'ADN avec TdT (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase), et (2) incorporation de Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dUTP (deoxyuridine triphosphate) dans le nucléotide polymères. Les spermatozoïdes positifs au TUNEL sont colorés en vert et les échantillons négatifs au TUNEL sont colorés en rouge et peuvent être directement détectés et quantifiés par microscopie à fluorescence. Ce kit est conçu pour être une technique non radioactive précise, rapide et simple pour détecter et quantifier le nombre de cellules apoptotiques. Il est spécifique car il marque les cassures de brins d'ADN générées lors de l'apoptose, ce qui permet au test de faire la distinction entre les cellules apoptotiques et nécrotiques.

Des statistiques descriptives seront utilisées pour rapporter les valeurs moyennes, médianes et minimales et maximales pour chaque variable. Le test exact pour le test de Friedman sera utilisé pour étudier la présence de différences entre les 3 techniques. Le test exact pour le test de rang signé de Wilcoxon sera utilisé pour les comparaisons par paires. Une correction de Bonferroni sera appliquée pour ajuster les comparaisons multiples. Le niveau de signification est fixé à p<0,05, bilatéral. L'analyse statistique sera effectuée au moyen de STATA 15.1 et SPSS 26.0 (progiciel statistique pour les sciences sociales). Un certain nombre de 50 patients seront inclus dans l'étude.

Les résultats obtenus aideront à améliorer le processus de sélection des spermatozoïdes dans le laboratoire de FIV