Caratterizzazione della popolazione di spermatozoi seguendo diverse procedure di selezione (CROSP)

Sono attualmente disponibili diverse procedure per selezionare la popolazione di spermatozoi che verrà utilizzata per l'inseminazione degli ovociti durante la riproduzione medica assistita (MAR). La popolazione selezionata dovrebbe contenere spermatozoi perfettamente funzionanti che possiedano la capacità di raggiungere il sito di fecondazione e consentire una fecondazione ottimale e lo sviluppo dell'embrione. Queste capacità sono strettamente dipendenti da specifiche caratteristiche morfo-funzionali dello sperma come, ma non limitate a, motilità, anomalie morfologiche, stato apoptotico [traslocazione della fosfatidilserina (stadi precoci dell'apoptosi)] e frammentazione del DNA (stadi successivi dell'apoptosi), Il presente studio mira a determinare quali delle tecniche di selezione degli spermatozoi utilizzate nel nostro laboratorio di fecondazione in vitro portano alla selezione della popolazione di spermatozoi migliore/sana in base ai loro parametri morfo-funzionali. A tale scopo, il seme crudo non utilizzato dopo le analisi diagnostiche di routine sarà suddiviso in 3 frazioni e processato immediatamente con diversi metodi di preparazione del seme: 1) DGC, 2) DGC e MACS e 3) MSS.

Gli spermatozoi selezionati con ciascun metodo saranno analizzati per parametri morfologici e funzionali.

La concentrazione iniziale di spermatozoi (×106/ml) sarà valutata utilizzando una camera di conteggio.

La motilità spermatica sarà valutata su 200 spermatozoi a 40 ingrandimenti ei risultati saranno espressi in percentuale.

Dopo ogni procedura di selezione, la concentrazione e la motilità saranno determinate con l'uso di una camera di conteggio di Neubauer.

Gli spermatozoi con morfologia normale saranno controllati su strisci colorati con Diff Quick Staining su strisci essiccati, 200 spermatozoi saranno classificati come normali/anormali secondo i severi criteri di Kruger.

Traslocazione della fosfatidilserina (PS) (marker apoptotico precoce): sarà analizzata mediante microscopia a fluorescenza dopo incubazione in sospensione di spermatozoi con annessina V-FITC (isotiocianato di fluoresceina) e ioduro di propidio (PI). Gli spermatozoi saranno classificati come: spermatozoi vitali senza traslocazione PS (PI negativo/Annessina negativo); vitale con PS traslocato (PI negativo/Annessina positivo); morto (PI positivo/Annessina positivo o PI positivo/Annessina negativo).

L'indice di frammentazione del DNA (percentuale di cellule spermatiche che mostrano la frammentazione del DNA per numero di cellule analizzate; DFI) sarà analizzato utilizzando il protocollo di analisi TUNEL (terminal deoxynucleotidyl-transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-fluorescein nick end labeling) (kit disponibile in commercio "In Situ Cell Death Rilevamento"; Diagnostica Roche). La scissione del DNA genomico durante l'apoptosi porta sia a rotture a singolo filamento (tacche) che a frammenti di DNA a doppio filamento ea basso peso molecolare. Queste rotture del filamento di DNA possono essere identificate in una reazione enzimatica in due fasi: (1) etichettatura delle rotture del filamento di DNA con TdT (terminale deossinucleotidil transferasi) e (2) incorporazione di isotiocianato di fluoresceina (FITC)-dUTP (deossiuridina trifosfato) nel nucleotide polimeri. Gli spermatozoi TUNEL positivi si colorano di verde e i campioni TUNEL negativi si colorano di rosso e possono essere rilevati e quantificati direttamente mediante microscopia a fluorescenza. Questo kit è progettato per essere una tecnica non radioattiva precisa, veloce e semplice per rilevare e quantificare il numero di cellule apoptotiche. È specifico in quanto identifica le rotture del filamento di DNA generate durante l'apoptosi, il che consente al test di discriminare tra cellule apoptotiche e necrotiche.

Le statistiche descrittive saranno utilizzate per riportare i valori medi, mediani e minimi e massimi per ciascuna variabile. Verrà utilizzato il test esatto per il test di Friedman per indagare la presenza di differenze tra le 3 tecniche. Il test esatto per il test dei ranghi con segno di Wilcoxon verrà utilizzato per i confronti a coppie. Verrà applicata una correzione Bonferroni per adeguarsi a confronti multipli. Il livello di significatività è fissato a p<0,05, 2 code. L'analisi statistica sarà effettuata mediante STATA 15.1 e SPSS 26.0 (Statistical Package for the Social Sciences). Un numero di 50 pazienti sarà incluso nello studio.

I risultati ottenuti contribuiranno a migliorare il processo di selezione degli spermatozoi nel laboratorio di fecondazione in vitro