Karakterisering av sædpopulasjon etter ulike seleksjonsprosedyrer (CROSP)

Ulike prosedyrer er for tiden tilgjengelige for å velge spermpopulasjonen som skal brukes til å inseminere oocyttene under Medical Assisted Reproduction (MAR). Den valgte populasjonen bør inneholde fullt funksjonelle sædceller som har evnen til å nå befruktningsstedet og tillate optimal befruktning og embryoutvikling. Disse evnene er strengt avhengig av spesifikke spermmorfofunksjonelle funksjoner som, men ikke begrenset til, motilitet, morfologiske abnormiteter, apoptotisk status [fosfatidylserin-translokasjon (tidlige stadier av apoptose)] og DNA-fragmentering (senere stadier av apoptose), denne studien. har som mål å bestemme hvilke av spermseleksjonsteknikkene som brukes i vårt IVF-laboratorium som fører til seleksjon av den beste/friske spermpopulasjonen basert på deres morfo-funksjonelle parametere. For dette formålet vil ubrukt rå sæd etter rutinediagnostisk analyse deles i 3 fraksjoner og vil bli behandlet umiddelbart ved hjelp av forskjellige sædprepareringsmetoder: 1) DGC, 2) DGC og MACS, og 3) MSS.

Sædcellene valgt av hver metode vil bli analysert for morfologiske og funksjonelle parametere.

Initial spermkonsentrasjon (×106/ml) vil bli vurdert ved hjelp av et tellekammer.

Spermmotilitet vil bli evaluert på 200 spermatozoer under 40x forstørrelser og resultatene vil bli uttrykt som prosenter.

Etter hver utvalgsprosedyre vil konsentrasjon og motilitet bli bestemt ved bruk av et Neubauer tellekammer.

Spermatozoer med normal morfologi vil bli kontrollert på utstryk farget med Diff Quick Staining på tørkede utstryk, 200 sædceller vil bli klassifisert som normale/unormale i henhold til Krugers strenge kriterier.

Fosfatidylserin (PS) translokasjon (tidlig apoptotisk markør): vil bli analysert ved hjelp av fluorescensmikroskopi etter inkubering av sædcellesuspensjon med Annexin V-FITC (Fluorescein Isothiocyanat) og propidiumjodid (PI). Sædceller vil bli klassifisert som: levedyktige sædceller uten PS-translokasjon (PI-negativ/Annexin-negativ); levedyktig med translokert PS (PI negativ/Annexin positiv); død (PI positiv/Annexin positiv eller PI positiv/Annexin negativ).

DNA-fragmenteringsindeks (prosentandel av sædceller som viser DNA-fragmentering per antall analyserte celler; DFI) vil bli analysert ved bruk av terminal deoksynukleotidyl-transferase-mediert deoksyuridintrifosfat-fluorescein nick end-merking (TUNEL) analyseprotokoll (kommersielt tilgjengelig sett "In Situ Cell Death" Deteksjon"; Roche Diagnostic). Spaltningen av genomisk DNA under apoptose fører til både enkelttrådsbrudd (hakk) og dobbelttrådede DNA-fragmenter med lav molekylvekt. Disse DNA-trådbruddene kan identifiseres i en enzymatisk reaksjon i to trinn: (1) merking av DNA-trådbrudd med TdT (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase), og (2) inkorporering av Fluorescein isothiocyanat (FITC)-dUTP (deoksyuridintrifosfat) i nukleotid polymerer. TUNEL-positive sædflekker grønn og TUNEL-negative prøver farges røde, og den kan påvises og kvantifiseres direkte ved fluorescensmikroskopi. Dette settet er designet for å være en presis, rask og enkel ikke-radioaktiv teknikk for å oppdage og kvantifisere antallet apoptotiske celler. Den er spesifikk ettersom den merker DNA-trådbrudd generert under apoptose, noe som gjør at testen kan skille mellom apoptotiske og nekrotiske celler.

Beskrivende statistikk vil bli brukt for å rapportere gjennomsnitt, median og minimums- og maksimumsverdier for hver variabel. Nøyaktig test for Friedmans test vil bli brukt for å undersøke tilstedeværelsen av forskjeller på tvers av de 3 teknikkene. Nøyaktig test for Wilcoxon signert rangtest vil bli brukt for parvise sammenligninger. En Bonferroni-korreksjon vil bli brukt for å justere for flere sammenligninger. Signifikansnivå er satt til p<0,05, 2-tailed. Statistisk analyse vil bli utført ved hjelp av STATA 15.1 og SPSS 26.0 (Statistisk pakke for samfunnsvitenskap). Et antall på 50 pasienter vil bli inkludert i studien.

Resultatene som oppnås vil bidra til å forbedre spermseleksjonsprosessen i IVF-laboratoriet