Charakterizace spermatu podle různých výběrových postupů (CROSP)

V současné době jsou k dispozici různé postupy pro výběr populace spermií, které budou použity k inseminaci oocytů během lékařské asistované reprodukce (MAR). Vybraná populace by měla obsahovat plně funkční spermie, které mají schopnost dosáhnout místa oplodnění a umožnit optimální oplodnění a vývoj embrya. Tyto schopnosti jsou striktně závislé na specifických morfofunkčních rysech spermií, jako jsou mimo jiné motilita, morfologické abnormality, apoptotický stav [translokace fosfatidylserinu (ranná stadia apoptózy)] a fragmentace DNA (pozdější stadia apoptózy). si klade za cíl zjistit, které z technik výběru spermií používaných v naší IVF laboratoři vedou k výběru nejlepší/zdravé populace spermií na základě jejich morfofunkčních parametrů. Za tímto účelem bude nepoužité surové sperma po rutinní diagnostické analýze rozděleno do 3 frakcí a bude okamžitě zpracováno různými metodami přípravy spermatu: 1) DGC, 2) DGC a MACS a 3) MSS.

Spermatické buňky vybrané každou metodou budou analyzovány na morfologické a funkční parametry.

Počáteční koncentrace spermií (×106/ml) bude hodnocena pomocí počítací komůrky.

Pohyblivost spermií bude hodnocena na 200 spermiích při 40násobném zvětšení a výsledky budou vyjádřeny v procentech.

Po každém selekčním postupu bude koncentrace a motilita stanovena s použitím Neubauerovy počítací komory.

Spermie s normální morfologií budou kontrolovány na nátěrech obarvených pomocí Diff Quick Stained na vysušených nátěrech, 200 spermií bude klasifikováno jako normální/abnormální podle přísných Krugerových kritérií.

Translokace fosfatidylserinu (PS) (časný apoptotický marker): bude analyzována pomocí fluorescenční mikroskopie po inkubaci suspenze spermií s Annexinem V-FITC (Fluorescein Isothiokyanát) a propidium jodidem (PI). Spermie budou klasifikovány jako: životaschopné spermie bez PS translokace (PI negativní/Annexin negativní); životaschopné s translokovaným PS (PI negativní/Annexin pozitivní); mrtvý (PI pozitivní/Annexin pozitivní nebo PI pozitivní/Annexin negativní).

Index fragmentace DNA (procento spermií vykazujících fragmentaci DNA na počet analyzovaných buněk; DFI) bude analyzován pomocí testovacího protokolu terminálního deoxynukleotidyl-transferázou zprostředkovaného deoxyuridintrifosfát-fluoresceinem (TUNEL) testovacího protokolu (komerčně dostupná sada "In situ Cell Death" Detekce"; Roche Diagnostic). Štěpení genomové DNA během apoptózy vede jak k jednovláknovým zlomům (nickům), tak k dvouvláknovým fragmentům DNA s nízkou molekulovou hmotností. Tyto zlomy řetězce DNA lze identifikovat enzymatickou reakcí ve dvou fázích: (1) značení zlomů řetězce DNA pomocí TdT (terminální deoxynukleotidyltransferáza) a (2) začlenění fluorescein isothiokyanátu (FITC)-dUTP (deoxyuridintrifosfát) do nukleotidu. polymery. TUNEL-pozitivní spermie se barví zeleně a TUNEL-negativní vzorky se barví červeně a lze je přímo detekovat a kvantifikovat fluorescenční mikroskopií. Tato souprava je navržena jako přesná, rychlá a jednoduchá neradioaktivní technika pro detekci a kvantifikaci počtu apoptotických buněk. Je specifický, protože označuje zlomy řetězce DNA generované během apoptózy, což umožňuje testu rozlišit mezi apoptotickými a nekrotickými buňkami.

Popisné statistiky budou použity k vykazování středních, středních a minimálních a maximálních hodnot pro každou proměnnou. Přesný test pro Friedmanův test bude použit ke zkoumání přítomnosti rozdílů mezi těmito 3 technikami. Pro párová srovnání bude použit přesný test pro Wilcoxonův znaménkový test. Bonferroniho korekce bude použita k úpravě pro vícenásobná srovnání. Hladina významnosti je nastavena na p<0,05, 2-tailed. Statistická analýza bude provedena pomocí STATA 15.1 a SPSS 26.0 (Statistický balíček pro společenské vědy). Do studie bude zahrnuto 50 pacientů.

Získané výsledky pomohou zlepšit proces výběru spermií v IVF laboratoři