Характеристика популяции сперматозоидов после различных процедур отбора (CROSP)

В настоящее время доступны различные процедуры для выбора популяции сперматозоидов, которые будут использоваться для оплодотворения ооцитов во время вспомогательной репродукции с помощью медицинских препаратов (MAR). Отобранная популяция должна содержать полностью функциональные сперматозоиды, обладающие способностью достигать места оплодотворения и обеспечивать оптимальное оплодотворение и развитие эмбриона. Эти способности строго зависят от конкретных морфофункциональных характеристик сперматозоидов, таких как, помимо прочего, подвижность, морфологические аномалии, апоптотический статус [транслокация фосфатидилсерина (ранние стадии апоптоза)] и фрагментация ДНК (более поздние стадии апоптоза). Настоящее исследование направлена ​​на определение того, какие из методов отбора сперматозоидов, используемых в нашей лаборатории ЭКО, приводят к отбору наилучшей/здоровой популяции сперматозоидов на основе их морфофункциональных параметров. Для этого неиспользованная сырая сперма после планового диагностического анализа будет разделена на 3 фракции и сразу обработана различными методами подготовки спермы: 1) DGC, 2) DGC и MACS и 3) MSS.

Сперматозоиды, отобранные каждым методом, будут проанализированы на морфологические и функциональные параметры.

Исходную концентрацию сперматозоидов (×106/мл) оценивают с помощью счетной камеры.

Подвижность сперматозоидов будет оцениваться на 200 сперматозоидах при 40-кратном увеличении, и результаты будут выражены в процентах.

После каждой процедуры отбора концентрацию и подвижность определяют с использованием счетной камеры Нойбауэра.

Сперматозоиды с нормальной морфологией будут проверены на мазках, окрашенных с помощью Diff Quick Staining на высушенных мазках, 200 сперматозоидов будут классифицированы как нормальные/аномальные в соответствии со строгими критериями Крюгера.

Транслокация фосфатидилсерина (PS) (маркер раннего апоптоза): будет проанализирована с помощью флуоресцентной микроскопии после инкубации суспензии сперматозоидов с аннексином V-FITC (изотиоцианат флуоресцеина) и йодидом пропидия (PI). Сперматозоиды будут классифицироваться как: жизнеспособные сперматозоиды без транслокации PS (отрицательные по PI/отрицательные по аннексину); жизнеспособны с транслоцированным PS (отрицательный PI/позитивный по аннексину); мертвые (PI положительный/Аннексин положительный или PI положительный/Аннексин отрицательный).

Индекс фрагментации ДНК (процент сперматозоидов, показывающих фрагментацию ДНК, по отношению к количеству проанализированных клеток; DFI) будет проанализирован с использованием протокола анализа терминальной дезоксиуридинтрифосфат-флуоресцеиновой метки (TUNEL) (коммерчески доступный набор «In Situ Cell Death»). Обнаружение»; «Рош Диагностика»). Расщепление геномной ДНК при апоптозе приводит как к одноцепочечным разрывам (разрывам), так и к двухцепочечным низкомолекулярным фрагментам ДНК. Эти разрывы цепей ДНК можно идентифицировать в ферментативной реакции в два этапа: (1) мечение разрывов цепей ДНК с помощью TdT (терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза) и (2) включение флуоресцеинизотиоцианата (FITC)-dUTP (дезоксиуридинтрифосфат) в нуклеотид. полимеры. TUNEL-положительные образцы спермы окрашиваются в зеленый цвет, а TUNEL-отрицательные образцы окрашиваются в красный цвет, и их можно непосредственно обнаружить и количественно оценить с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот набор предназначен для точного, быстрого и простого нерадиоактивного метода обнаружения и количественного определения количества апоптотических клеток. Он специфичен, поскольку маркирует разрывы нитей ДНК, образующиеся во время апоптоза, что позволяет тесту различать апоптотические и некротические клетки.

Описательная статистика будет использоваться для сообщения средних, медианных, а также минимальных и максимальных значений для каждой переменной. Точный тест для теста Фридмана будет использоваться для изучения наличия различий между тремя методами. Точный критерий знакового рангового критерия Уилкоксона будет использоваться для попарных сравнений. Для корректировки множественных сравнений будет применяться поправка Бонферрони. Уровень значимости установлен на уровне p<0,05, двусторонний. Статистический анализ будет проводиться с помощью STATA 15.1 и SPSS 26.0 (Статистический пакет для социальных наук). В исследование будут включены 50 пациентов.

Полученные результаты помогут улучшить процесс отбора сперматозоидов в лаборатории ЭКО.