Attività PET-MRI F-DOPA nel sistema mesocorticolimbico e sintomi depressivi nella previsione della compatibilità del trattamento

Introduzione:

Il disturbo depressivo maggiore (MDD) è un disturbo psichiatrico versatile con una prevalenza dell'8-12% della popolazione in molti paesi.

Secondo l'attuale approccio, la MDD è caratterizzata da un'attività ridotta dei neurotrasmettitori monoaminici, non è determinato se sia il risultato di differenze nella sensibilità dei loro recettori o dell'esaurimento nella fessura sinaptica a causa della bassa espressione o dell'iperattività mao-a/mao-b.

La maggior parte dei farmaci antidepressivi usati oggi si basa sulla teoria della depressione della deplezione delle monoamine. Questi farmaci includono inibitori selettivi della ricaptazione della serotonina (SSRI), inibitori della ricaptazione della serotonina norepinefrina (SNRI) o antidepressivi triciclici (TCA), che inibiscono tutti la ricaptazione di alcune o tutte queste monoamine, inducendo livelli elevati nella fessura sinaptica. Alcuni farmaci influenzano direttamente i recettori delle monoamine.

La neurotrasmissione disfunzionale della dopamina ha un ruolo essenziale nei deficit di attenzione, motivazione e anedonia che sono sintomi fondamentali del disturbo depressivo. La densità presinaptica D2r (recettore della dopamina 2) nella corteccia prefrontale (PFC) ha dimostrato di essere significativamente inferiore nei pazienti depressi rispetto agli individui sani.

Al momento, la maggior parte degli studi che utilizzano tecniche di imaging nei pazienti depressi utilizzano principalmente diversi tipi di imaging a risonanza magnetica (MRI) o imaging di medicina nucleare separato con traccianti di tomografia a emissione di positroni (PET). Il ruolo della risonanza magnetica tradizionale nella valutazione della depressione e di altri disturbi psichiatrici, in diversi studi, è finalizzato principalmente a differenziare le caratteristiche strutturali e quindi aiutare a rafforzare la diagnosi in tale aspetto. Ci sono diversi cambiamenti strutturali misurati nel cervello dei pazienti con MDD rispetto ai controlli. Tra questi diminuzione del volume dell'ippocampo mostrato anche rispetto ai pazienti con remissione, aumento del volume della ghiandola ipotalamo-ipofisi, riduzione del volume della corteccia prefrontale (PFC) e dei gangli basali. Questi risultati sono anche stabiliti in conformità al più grande studio di meta-analisi dei cambiamenti strutturali utilizzando scansioni MRI e TC eseguite fino ad oggi. Le scansioni PET danno indicazioni sul metabolismo generale o agente specifico del cervello. La maggior parte delle scansioni PET eseguite su pazienti depressi utilizza radioligandi FDG o 11-C serotonina. Solo pochi studi esaminano l'assorbimento di F-DOPA PET in pazienti depressi, principalmente con depressione parkinsoniana e uno con appiattimento affettivo o sintomi impulsivi su un campione molto piccolo (n=6). La maggior parte degli studi mostra un'indicazione di un ridotto assorbimento di DOPA nello striato, in particolare nel Nucleus Accombens (NAc). Sono necessarie ulteriori informazioni che indichino l'assorbimento di F-DOPA nelle regioni rilevanti del cervello nella MDD. Per quanto ne sappiamo, questo sarà il primo studio che utilizza [18F] F-DOPA PET/MRI in pazienti depressi. PET/MRI offre un vero imaging multimodale combinando anatomia, funzione e processi molecolari che consentiranno un'identificazione più accurata della valutazione della malattia.

Un fatto ben stabilito è che i fattori genetici insieme ai fattori ambientali che si verificano nel corso della vita probabilmente sono alla base della vulnerabilità alla depressione. Tuttavia, in una mega-analisi di diversi studi di associazione sull'intero genoma (GWAS), che hanno analizzato 1,2 milioni di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) autosomici e del cromosoma X, non è stato trovato alcun SNP che raggiungesse un significato a livello dell'intero genoma. Questa discrepanza tra l'ereditabilità sostanziale costantemente osservata della depressione maggiore (18) e il fatto che non siano state identificate varianti genetiche specifiche per contribuire in modo robusto al disturbo suggerisce altri meccanismi all'opera. L'epigenetica si riferisce ai cambiamenti nella struttura della cromatina che sono alla base dei cambiamenti nell'espressione genica e che non sono associati ad alterazioni nella sequenza del DNA. La metilazione del DNA è uno dei sistemi alla base dell'epigenetica. La metilazione del DNA richiede l'aggiunta di un gruppo metilico nella posizione 5' delle citosine nei dinucleotidi CpG. Dopo la metilazione della citosina, l'accesso dei fattori di trascrizione agli elementi regolatori è ridotto a causa dell'interferenza sterica. I modelli di metilazione del DNA sono ereditabili da un lato e dall'altro reagiscono dinamicamente all'ambiente. Questa caratteristica dell'epigenetica ne fa un meccanismo di regolazione, determinante l'espressione genica, che è congruente alla natura dei disturbi psichiatrici. Diversi modelli di metilazione del DNA sono osservati in diversi tessuti sottoposti a diversi ambienti. È persino diverso tra regioni cerebrali separate. Sono in corso studi di associazione su tutto l'epigenoma (EWAS). In uno di essi, nel tessuto PFC di soggetti depressi post mortem, i ricercatori hanno trovato un arricchimento nella crescita neuronale e siti di geni dello sviluppo come il fattore neurotrofico guidato dal cervello (BDNF). I livelli ridotti di BDNF sono un marcatore ben consolidato per la depressione. Livelli inferiori di proteina BDNF sono stati riportati anche nell'ippocampo di animali esposti a stress cronico. È interessante notare che la somministrazione di antidepressivi ha aumentato il BDNF ippocampale, prevenendo la diminuzione indotta dallo stress. Questi risultati sono intriganti data la perdita di volume dell'ippocampo osservata nei disturbi dell'umore e la diminuzione dei livelli sierici di BDNF in individui con disturbi dell'umore o tratti di personalità depressiva. Sulla base di questi dati preclinici e clinici convergenti, il gene BDNF rappresenta un obiettivo logico per le indagini genetiche sui disturbi dell'umore.

Un altro studio di associazione su tutto l'epigenoma che ha analizzato il DNA del sangue intero ha rilevato che i livelli plasmatici di IL-6 e proteina C-reattiva (CRP) erano aumentati in quelle persone con depressione per tutta la vita, e tra quelli con solo depressione, la metilazione di IL-6 ha mostrato una correlazione inversa con il plasma IL-6 e PCR.

Ad oggi non esiste una pratica di imaging comune nella clinica psichiatrica che consenta di differenziare quale terapia farmacologica sia ottimale per quale paziente. Per quanto ne sappiamo, questo sarà il primo studio a valutare la compatibilità del trattamento utilizzando la combinazione di [18F] F-DOPA PET/RM e pretrattamento per la valutazione dei sintomi.

Obiettivi e scopo dello studio:

Lo scopo dello studio è valutare la fattibilità della modalità di imaging e valutazione dei sintomi nella previsione della compatibilità del trattamento. Metabolismo della dopamina misurato nel sistema mesocorticolimbico (VTA-NAc-PFC) mediante 18F-FDOPA PET con risultati RM strutturali e funzionali in pazienti con diagnosi di depressione prima del trattamento.

Obiettivi principali:

1. Confrontando i livelli naïve della ricaptazione di F-DOPA in individui sani con pazienti depressi non trattati nel sistema mesocorticolimbico (VTA-NAc-PFC) e valutando le differenze strutturali tra i due gruppi nell'ippocampo, nella ghiandola ipotalamo-ipofisaria e nel sistema mesocorticolimbico (VTA- NAc-PFC) e fMRI in stato di riposo.

Obiettivi secondari:

1. Confrontando le differenze di metilazione del DNA nel plasma dei pazienti rispetto ai controlli sani.
2. Valutazione della correlazione tra il punteggio di gravità dei sintomi (valutato sulla base della Hamilton Rating Scale) al basale e dopo 6 mesi al repertorio di assorbimento di PET 18F-DOPA nel sistema mesocorticolimbico, misurazioni strutturali e metilazione del DNA.

Materiali e metodi:

Disegno dello studio: uno studio pilota prospettico.

Valutazione clinica:

Verrà determinata una misura quantitativa del carico dei sintomi attraverso una valutazione clinica basata sulla "Hamilton Rating Scale for Depression" e sulla base dei criteri del DSM-V al basale (pre-trattamento), 3 mesi e 6 mesi dopo l'inizio del trattamento. Secondo il DSM-5 la diagnosi di depressione richiede cinque (o più) dei seguenti sintomi che sono presenti durante lo stesso periodo di 2 settimane e rappresentano un cambiamento rispetto al funzionamento precedente: (1) umore depresso (2) perdita di interesse o piacere . (3) Significativa perdita di peso o peso. (4) Insonnia o ipersonnia. (5) Agitazione o ritardo psicomotorio.(6) Stanchezza o quasi perdita di energia. (7) Sentimenti di inutilità o colpa eccessiva o inappropriata.(8) Diminuzione della capacità di pensare o concentrarsi. (9) Pensieri ricorrenti di morte.

La valutazione dei sintomi della Hamilton Rating Scale sarà effettuata da uno psichiatra. Infine cercheremo di collegare gruppi specifici di sintomi alla compatibilità del trattamento in accordo con l'imaging e le scoperte molecolari. La compatibilità del trattamento con questi farmaci verrà confrontata con la percentuale di successo del trattamento in clinica secondo uno "standard di cura". La valutazione dei progressi del paziente sarà determinata dal cambiamento dei sintomi e/o da una seconda scansione attraverso le visite di follow-up dopo 3,6 mesi.

.Protocollo PET/RM diagnostico per immagini: utilizzeremo la valutazione della costante di velocità di assorbimento del precursore della dopamina 3,4-diidrossi-6-[18F]-fluoro-l-fenilalanina ([18F] FDOPA) (K(i)) che riflette il trasporto di L-dopa. Attività decarbossilasica dell'amminoacido L-aromatico, assorbimento vescicolare e numero di terminazioni nervose della dopamina. vorremmo misurare e confrontare l'assorbimento di [18F] F-DOPA nella rete mesocorticolimbica in pazienti depressi non medicati e individui sani. Esamineremo quindi il repertorio di assorbimento di [18F] F-DOPA e caratterizzeremo un tipico pattern spaziotemporale lungo diversi cervelli depressivi in ​​accordo con i molti tipi di manifestazione di sintomi e dati molecolari e demografici. Inoltre, implementeremmo nuove sequenze RM come l'imaging del tensore diffuso (DTI) e l'imaging pesato sulla suscettibilità (SWI) per valutare il tratto dopaminergico mesocoticolimbico e utilizzare le sequenze T1, T2 per misurare i volumi della ghiandola ippocampale e ipotalamo-ipofisaria in questi pazienti rispetto agli individui sani. Inoltre utilizzeremo la sequenza T2* per valutare l'imaging con mezzo di contrasto BOLD (Blood-Oxygen-Level Dependent) in stato di riposo. Inoltre i risultati della scansione saranno correlati alla valutazione clinica dei sintomi dei pazienti non medicati.

Tutte le scansioni verranno eseguite nel dipartimento di medicina nucleare del Tel-Aviv Assuta Medical Center utilizzando uno scanner PET/RM (Biograph mMR, Siemens AG, Erlangen, Germania) in conformità con le linee guida del produttore.

I pazienti sono tenuti a digiunare almeno 4 ore prima dell'arrivo in reparto. All'arrivo verrà posizionato un catetere endovenoso per la somministrazione di radiofarmaci e gadolinio. I pazienti riceveranno un'iniezione endovenosa di 10 mCi di 18F-FDOPA sul tavolo PET MR e la scansione inizierà immediatamente. I parametri della PET dinamica saranno acquisiti insieme alle diverse sequenze RM. La RM del cervello includerà le seguenti sequenze: sequenza di recupero dell'inversione attenuata del fluido T1, T2 e T2 (FLAIR), sequenze pesate suscettibilità (SWI), immagini tensoriali diffuse (DTI), segnali dipendenti dal livello di ossigenazione del sangue (BOLD) per imaging funzionale in stato di riposo. Inoltre, verrà valutata la perfusione cerebrale con e senza gadolinio. Una mappa anatomica stereotassica del cervello sarà stratificata in congruenza con le scansioni utilizzando il software ExploreDTI.

Per le sequenze con mezzo di contrasto utilizziamo Dotarem (acido gadoterico) (0,2 ml/kg, 0,1 mmol/kg a 2 ml/s, 20 ml di soluzione salina) Il tempo totale di scansione sarà di circa 45 minuti.

Raccolta dati e procedure:

Per i volontari sani idonei, i seguenti dati saranno registrati al basale:

1. Parametri di base: data di nascita, sesso, stato socioeconomico, etnia, fumo, consumo di alcol.
2. Storia medica dettagliata.
3. Elenco dei farmaci
4. Valutazione dei sintomi utilizzando la scala di valutazione Hamilton per la depressione
5. Campione di sangue

Per i pazienti depressi idonei, i seguenti dati verranno registrati al basale, dopo 3 mesi e dopo 6 mesi.

1. Parametri di riferimento: data di nascita, sesso,
2. Storia medica dettagliata.
3. Elenco dei farmaci
4. Valutazione dei sintomi utilizzando la scala di valutazione Hamilton per la depressione
5. Campione di sangue
6. Diagnosi clinica e insorgenza dei sintomi.

Raccolta di campioni biologici:

I campioni di sangue verranno prelevati da pazienti e controlli sani prima delle scansioni per la valutazione del metilione del DNA dell'intero genoma nel plasma del sangue periferico. Verranno prelevati campioni di sangue da controlli sani e pazienti depredati al basale. Da soggetti depressi, il sangue verrà prelevato anche dopo 6 mesi dalla data di inizio del trattamento per la valutazione dell'espressione genica mRNA o proteina di marcatori specifici sulla base di risultati epigenetici dalla linea di base.

Analisi della metilazione del DNA del promotore dell'intero genoma:

La procedura utilizzata per l'analisi MeDIP è stata adattata da protocolli precedentemente pubblicati.(13,14) In breve, 2 μg di DNA vengono sonicati e il DNA metilato viene immunoprecipitato usando anti-5-metil-citosina (Eurogentec, Fremont, CA, USA). Il complesso DNA-anticorpo è stato immunoprecipitato con la proteina G e il DNA metilato è stato quindi risospeso in tampone di digestione (50 mM TRisHCl pH8; 10 mM EDTA; 0,5% SDS) e trattato con proteinasi K durante la notte a 55°C. L'input e la frazione legata vengono purificati, amplificati utilizzando il kit di amplificazione del genoma intero (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ed etichettati per l'ibridazione di microarray rispettivamente con Cy3-dUTP e Cy5-dUTP, utilizzando l'etichettatura enzimatica CGH Kit (Agilent Technologies, Mississauga, ON, Canada) secondo le istruzioni del produttore. Sono stati utilizzati array di tiling progettati su misura (Agilent Technologies). Tutte le fasi delle procedure di ibridazione, lavaggio, scansione ed estrazione delle caratteristiche vengono eseguite in conformità con il protocollo Agilent Technologies per l'analisi chipon-chip. Le intensità dei microarray estratti vengono elaborate e analizzate utilizzando l'ambiente software R per il calcolo statistico (//www.r-project.org/).

Convalida gene-specifica:

la validazione dei dati MeDIP sarà eseguita applicando la PCR quantitativa in tempo reale (QPCR) utilizzando il metodo 2-ΔΔCt. I dati saranno espressi come medie di gruppo±s.e.m. Il software Graphpad 5 verrà utilizzato per eseguire test U Mann-Whitney a una coda.

Estrazione dell'RNA dal sangue umano:

il sangue per l'estrazione dell'RNA verrà raccolto prima dell'iniezione del radioligando e prelevato in provette PAXgene Blood RNA (PreAnalytiX, Hombrechtikon, Svizzera). L'RNA viene estratto utilizzando il PAXgene Blood RNA Kit (Qiagen). La qualità e la quantità dei campioni di RNA saranno analizzate utilizzando un bioanalizzatore Agilent 2100 (Agilent Technologies, Böblingen, Germania).

Analisi dell'espressione genica nel sangue umano:

La trascrizione inversa sarà eseguita utilizzando il kit di trascrizione inversa cDNA ad alta capacità (Life Technologies, Darmstadt, Germania). I livelli di espressione genica saranno analizzati mediante QPCR e il metodo 2-ΔΔCt. I dati saranno espressi come medie di gruppo±s.e.m. La significatività statistica sarà verificata utilizzando i test U di Mann-Whitney a una coda.

Pirosequenziamento:

La regione del promotore di specifici geni sarà analizzata mediante pirosequenziamento. In breve, frammenti di DNA trattato con bisolfito (EpiTect Bisulfite Kit, Qiagen) saranno amplificati mediante informazioni sui primer PCR (HotStar Taq DNA Polymerase, Qiagen) utilizzando un forward primer non modificato e un reverse primer marcato con biotina (Eurofins, Ebersberg, Germania) . Il pirosequenziamento verrà eseguito utilizzando un sistema PyroMark Q24 Advanced (Qiagen; informazioni sui primer vedere la tabella supplementare S2) in conformità con il protocollo del produttore. I campioni di DNA di controllo EpiTect metilato e non metilato (Qiagen) saranno utilizzati come controlli per la conversione del bisolfito, l'amplificazione e il pirosequenziamento. La percentuale di metilazione in ciascun sito CpG sarà quantificata utilizzando il software PyroMark Q24 Advanced versione 3.0.0 (Qiagen) Il sequenziamento sarà eseguito in triplicato. Il filtraggio del controllo di qualità e le analisi statistiche dei risultati del pirosequenziamento saranno condotti utilizzando R versione 2.15.3 (http://www.r-project.org). Le misurazioni contrassegnate come inaffidabili dal software Pyromark verranno rimosse dal set di dati. Le misurazioni triplicate verranno calcolate in media dopo la rimozione dei valori anomali (valori che si discostano di oltre il 3%). Verrà utilizzato un test U di Mann-Whitney per confrontare la percentuale media di metilazione dei siti CpG per l'ELS rispetto ai gruppi di controllo. I dati saranno presentati come media ± s. e.m.

Analisi genetica:

I genotipi saranno studiati utilizzando i dati GWAS di un precedente studio di MDD. dbSNP dei geni scelti (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP) sarà ricercato per SNP (single-nucleotide polymorphisms) attraverso i geni. Verrà eseguito il test basato su set, come implementato in PLINK (v1.0.7)39 (con opzioni predefinite e 105 permutazioni), per testare l'associazione tra MDD e l'intero set di varianti genetiche nel set di dati

Risultati della RM:

• Misurazioni 3D T1,T2 (valutazione del volume) dell'ippocampo, della ghiandola ipotalamo-ipofisaria e del mesocorticolimbico.
• Misurazioni DTI nel tratto dopaminergico mesocorticolimbico.
• Confronto delle reti cerebrali f-MRI (BOLD) in stato di riposo in pazienti con depressione con mappe normali

Risultati dell'ANIMALE DOMESTICO:

1. La valutazione visiva e le misurazioni quantitative di F-DOPA statica (ad es. SUVmax e SUVmean) saranno eseguite bilateralmente nel VTA, NAc, PFC.
2. Verranno misurate le misurazioni dei parametri dinamici della F-DOPA come Ki quando disponibili (ad esempio, tempo al picco, valore di picco, ecc.).

Statistiche:

Le caratteristiche del paziente saranno riassunte utilizzando statistiche descrittive. Le variabili quantitative saranno presentate come media e DS, le variabili qualitative saranno presentate come frequenze.

Il coefficiente di correlazione di Pearson verrà utilizzato per misurare la forza della relazione tra la PET nelle diverse aree cerebrali ei sintomi del cluster.

Verrà utilizzato un t-test per confrontare i valori medi dei diversi parametri. Dimensione del campione: questo è uno studio pilota per il quale è richiesta una dimensione del campione di 60 soggetti (30 individui sani e 30 pazienti).

Campionamento dei partecipanti: verranno arruolati consecutivamente tutti i pazienti che soddisfano i criteri di inclusione e forniscono il consenso informato.

Riservatezza:

Tutti i dati saranno codificati e il soggetto sarà identificato solo dalle iniziali del soggetto e dal numero di studio del soggetto.

La codifica verrà eseguita dagli investigatori e verrà salvata sui loro computer protetti e nel file dell'investigatore chiuso in un armadio nell'ufficio dell'investigatore principale.

Tutte le segnalazioni e le comunicazioni relative ai soggetti dello studio utilizzeranno il codice fornito, senza dati personali.