根治的前立腺膀胱切除術後の術中前立腺ロージ生検 (iPROLOGX) (iPROLOGX)

このプロジェクトは、グルタチオン S-トランスフェラーゼ P 1 (GSTP1) のメチル化状態を分析することにより、根治的前立腺膀胱摘除術の切除断端における潜在性腫瘍細胞の検出に関するものです。 腺切除標本は、前立腺窩の 9 つの定義された領域から取得されます。 生検は2つの部分に分けられます。 1 つの部分は病理組織学的分析に使用され、他の部分は分子遺伝学的分析に使用されます。 結果は相関します。腫瘍の病期、グリーソン スコア、前立腺特異抗原 (PSA) を使用します。

膀胱癌を有する前立腺癌陰性対照群。

DNA分離

-80°Cで保存された生検からのDNAは、製造元の指示のプロトコル1に従って、innuPREP DNAミニキット（Analytik Jena、Jena、Germany）を使用して分離されました。 DNA は 50 µl の溶出バッファーで溶出しました。 Nanodrop 2000 を使用して、濃度と純度を分析しました。

DNA バイサルファイト修飾

EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN、ヒルデン、ドイツ) を使用して、製造元の指示に従って DNA を修飾しました。 サンプルは 20 µl の溶出バッファーで 1 回溶出しました。

定量的メチル化特異的 PCR

GSTP1 のメチル化状態は、Applied Biosystems (ダルムシュタット、ドイツ) の StepOnePlus Real-Time PCR System および StepOne Software v2.1 を使用した定量的メチル化特異的 PCR (Q-MSP) によって分析されます。 Q-MSP は、遺伝子アクチンおよび GSTP1 を分析するために二重に実行されました。 高メチル化 GSTP1 を増幅および検出するために使用されるプライマーおよびテスト プローブの配列は、蛍光色素 FAM で標識された 5'-AgTTgCgCggCgATTTC (フォワード プライマー)、5'-gCCCCAATACTAAATCACgACg (リバース プライマー)、および 5'-CggTCgACgTTCggggTgTAgCg (taqman プローブ) でした。 アクチンを増幅および検出するために使用されるプライマーおよびテスト プローブの配列は次のとおりです。

Q-MSPは、50℃で2分間、95℃で15分間行った。 その後、95°C で 1 秒間、60°C で 1 分間を 50 サイクル。 陽性対照として、ＤＵ１４５およびＬＮＣａｐの亜硫酸水素塩変換ＤＮＡを使用した。 DNA を置き換えた蒸留水を用いたブランク反応は、陰性対照 (NTC) として機能しました。