肺移植片のマイクロバイオームおよびその炎症反応に対する体外肺灌流システムの影響。 (ExBioma)

サンプルの採取と保管

• バル:
• 技術: 気管支鏡がセグメント 6 に挿入され、滅菌生理食塩水のアリコートが注入されます。 この手順は、右肺の場合はセグメント 3 と 5 で繰り返され、左肺の場合はセグメント 6 と舌側で繰り返されます。 各グラフトあたり 20 ～ 30cc の BAL が完成します。
• 保管: サンプルは採取後すぐに凍結され、解凍されないように冷却アキュムレーターを備えた研究室に移送されます。
• 分析: 肺マイクロバイオームが分析されます。
• 肺生検:
• 技術: 非吸収性の自動縫合糸を使用して、最小 2 cm3 の肺生検が行われます。
• 保管: サンプルは RNA Stabilization solution Reagent (QIAGEN) に保存されます。これにより、凍結するまで標本を室温で保存でき、RNA の分解が回避されます。
• 分析: 炎症シグナル転写の RNA シーケンス。
• 体外灌流液溶液:
• 手法: 20cc シリンジを使用して無菌サンプルを採取します。
• 保管: サンプルは採取後すぐに凍結され、解凍されないように冷却アキュムレーターを備えた研究室に移送されます。
• 分析: マイクロバイオーム分析
• 保存液：
• 手法: 20cc シリンジを使用して無菌サンプルを採取します。
• 保管: サンプルは採取後すぐに凍結され、解凍されないように冷却アキュムレーターを備えた研究室に移送されます。
• 分析: マイクロバイオームおよびサイトカイン分析

すべてのサンプルは-80℃の冷凍庫に保管されます。

- マイクロバイオーム分析 微生物の多様性を分析するために、16S 遺伝子の V4 可変領域が PCR によって細菌の DNA から増幅されます。 アンプリコンはイルミナ (MiSeq) テクノロジーを使用して配列決定されます。 サンプルが処理され、サンプルごとに 1 シーケンスあたり 10,000 を超える 300 bp シーケンスが生成されます。

遺伝子発現解析 RNA 抽出は市販の RNeasy Mini Kit (QIAGEN) を使用して実行されます。 遺伝子発現解析は、SignArray (AnyGenes®、パリ、フランス) の事前設計された TransplantRejection パネルを使用して、定量的 PCR (qPCR) によって実行されます。このパネルには、移植拒絶における免疫応答に関連すると記載されている 84 個の遺伝子が含まれます。 パネルに含まれる遺伝子: CX3CR1、ICAM1、ITGA2、ITGAE、ITGAM、PECAM1、THBS1、THBS2、VCAM1、COL1A2、CCR5、CCR7、CD40、CD40LG、CD80、CD86、CTLA4、CXCR3、STAT4、TGFB1、CD44 、CTGF、MMP1、MMP2、MMP7、MMP9、BMP7、CCL11、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CSF2、CXCL10、IFNG、IL10、IL12A、IL13、IL16、IL1B、IL2、IL2RA、IL3、IL32、IL4、IL5 、IL6、IL8、TNF、TGFB2、TGFB3、TIMP1、VEGFA、MS4A1、CXCL11、CXCL9、CXCR4、ADAM17、C3、CASP1、CASP3、CASP8、CCR2、CCR3、CD14、CD28、CD8A、FAS、FASLG、FCGR1A、GZMA 、GZMB、NFKB1、NOS2、PRF1、PSMB9、STAT1、STAT6、TAP1、TLR3、TLR4、TLR9、TNFAIP3、TNFSF10。

- サイトカイン分析 灌流液中のサイトカインの測定は、さまざまな分泌タンパク質 (サイトカイン、ケモカイン、成長因子など) の同時定量と検出を可能にする Luminex™ xMAP™ テクノロジー (複数分析物プロファイリング) に基づくイムノアッセイを使用して実行されます。 .) 対象の遺伝子産物用に特別に設計されたパネルを使用します。

サイトカイン レベルは、さまざまなサイトカインのマルチパラメトリック分析を可能にする Luminex™ xMAP™ テクノロジーに基づくイムノアッセイを使用して測定されます。 この目的を達成するために、全身レベルでのサイトカインおよびその他の炎症誘発性ケモカインの産生に対するスタチンの影響に関する出版文献、および肺移植に関与するサイトカインに関する文献的証拠に基づいて、パーソナライズされたサイトカインパネルが設計されます。 この目的のために設計されたパネルで分析されたサイトカインは、IFN ガンマ、IL-1 ベータ、IL-6、IL-8 (CXCL8)、IL-18、IP-10 (CXCL10)、MCP-1 (CCL2)、MIP-1 です。 1 アルファ (CCL3)、TNF アルファ、VEGF-D (カスタム プロカルタプレックス マルチプレックス パネル、Invitrogen、ThermoFisher Scientific、マサチューセッツ州、米国)。 免疫学的分析は、試薬に付属の Invitrogen ProcartaPlex Analyst 1.0 ソフトウェアを使用して実行されます。

- 配列のバイオインフォマティクス分析 各サンプルの微生物組成を取得するには、QIIME ソフトウェアを使用します。 QIIME は、系統発生情報と多変量統計手法を使用して微生物群集を比較し、たとえば微生物群集が統計的に異なるかどうかを判断するソフトウェア パイプラインです。 このプログラムはまた、これらの違いに最も寄与する種を特定し、サンプルの特定のグループを特徴付けるさまざまなタイプのパターンを発見します。