口臭および歯周病関連パラメータ

歯周病が口臭と関連しているかどうかについては、文献で議論があり、この研究では、歯周病が口臭関連パラメーターとどのように関連しているかを理解しようとしています。

臨床プロトコル:

ギリシャ、テッサロニキのアリストテレス大学の歯周病学科で、全身的に健康な非喫煙者 78 人が口臭のスクリーニングを受けました。 これらは口臭を訴えていない被験者であった。 適合性に関する最初のスクリーニングと、テッサロニキのアリストテレス大学歯科学校の倫理委員会によって承認された署名済みのインフォームド コンセントを得た後、プラーク インデックス (PI)、臨床プロービング深度 (CPD)、臨床アタッチメントを含む口全体の歯周チャートが記録されました。レベル (CAL) および手動歯周プローブ (Hu-Friedy XP-23/QW) を使用して、歯ごとに 6 箇所のプロービングによる出血 (BOP) を行います。 臨床選択基準を満たした被験者は、慢性歯周炎（N=28）、慢性全身性歯肉炎（N=23）、または健康な個人（27）に分類され、さらに臨床的および微生物学的に監視されました。

舌苔の評価：

Winkel Tongue Coating Index (Winkel et al., 2003) は、舌の背を六分儀に分割することによって視覚的に決定されました。 預金の量に応じて、各六分儀に 0 から 2 までのスコアが与えられ、これらのスコアが加算されて、合計が 0 から 12 の範囲になります。

舌サンプルの収集:

リアルタイム PCR による 2 つの推定歯周病原体、ポルフィロモナス ジンジバリスとフソバクテリウム ヌクレアタムの定量分析のために、舌背の後部から標本を採取しました。

プロービングおよび舌のサンプリングでの出血が官能評価および主に舌臭の評価に干渉するのを避けるために、口臭について 4 日以内に 1 日の同じ時間に 2 回目の訪問で被験者を呼び戻しました。評価。 この短い時間内に、参加者は、口臭評価が実施される次の訪問の48時間前を除いて、通常の食事と口腔衛生習慣を変更しないように求められました（Roldán et al。、2003; Donaldson et al。、2007）。 . 各参加者には、飲食物と口腔衛生習慣に関する書面による指示が与えられました。 より詳細には、スパイシーな食べ物、タマネギ、ニンニク、アルコール、うがい薬は、検査前に避けられました。 評価の朝、コーヒー、ミント、チューインガム、口腔衛生習慣、香りの化粧品、アフターシェーブローションは避けられました。 臭気評価の少なくとも 2 時間前に、水の消費と水による口内ゆすぎを許可した。 同様に、口臭の官能評価を行った裁判官は、試験に着手する前の 24 時間、参加者と同じ指示に従った。

口臭の評価:

• Halimeter® (Halimeter® RH-17、Interscan Corporation、Chatsworth、CA、USA) を使用して、揮発性硫化化合物 (VSC) の濃度を 10 億分の 1 (ppb) 単位で測定しました (Rosenberg et al., 1991)。 部屋の温度と湿度の日々の変動を最小限に抑えるために、評価は常にクリニックの同じ歯科用椅子で10.00-12.00の間に実行されました（Liu et al。、2006）。
• 0 から 5 までの官能評価 (ORG) (Rosenberg et al., 1991) では、次のパラメーターの匂いが評価されました。

口全体の空気 (ORG1) - 被験者は、スクリーンを通して長さ 20 cm のチューブに静かに息を吐き出すように求められました。これは、チューブの反対側で口臭を評価する臭気審査員とのアイコンタクトを避けるためです (Murata et al., 2002)。 ;舌背の前部 (ORG2) - 被験者は手首をなめ、匂いが評価される前にその領域が乾くまで数秒待つように求められました。舌の後方領域 (ORG3) - 材料は、プラスチック製のスプーンを使用して、標準化された方法で舌背の後方から採取されました。鼻の空気 - 被験者は、口臭に関連している可能性のある口腔外の原因を排除するために、反対側の鼻孔を指で覆った後、一方の鼻孔から息を吐き出すように求められました.

校正された 1 人の「審査官」が歯周測定値とハリメーターの測定値を記録し、校正された 1 人の「裁判官」が口臭の官能評価を行いました。 すべての参加者は、同じ試験官と審査員によって評価されました。 偏りのないデータ収集を保証するために、臭気審査員は、Halimeter® 測定値と個人の臨床状態に関して盲検化されました。 この調査の前と調査中に、臭気判定者と追加の臭気「評価者」が、強度が 25 ～ 6075 ppm の広範囲の n-ブタノール溶液に対して繰り返し標準化されました (Nachnani et al., 2005; Saad et al., 2005) および歯周病クリニックに通う患者の口臭について. 審査員の評価の信頼性を評価するために、審査員と評価者は、互いのスコアを意識することなく、多くの研究参加者の口臭を調べました。 スコア間には統計的に有意な相関関係が見られました (口全体の空気の臭いについて、スピアマンのロー = 0.64、p<0.001) (S.A.C.M.O.T.、2002)。 データ分析には裁判官の評価のみが使用されたことに注意してください。

被験者は、口内空気全体の感覚刺激スコアが 2 以上の場合、および/または Halimeter® の測定値が 140 p.p.b. を超えた場合に、口臭陽性 (+) と指定されました。

リアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応:

P. gingivalis 株 W50 および F. nucleatum 株 ATCC 10953 の DNA は、グラスゴー大学歯科学校で標準プロトコルに従って調製されました。 簡単に言えば、P. gingivalis と F. nucleatum を気難しい嫌気性寒天培地で培養し、3 ～ 7 日後に収穫しました。 単一の寒天プレートから微生物をスワブで採取し、0.1 mM EDTA 二ナトリウムを含む PBS (PBSE) に分散させました。 ＰＢＳで１回洗浄した後、それらを１ｍｌの滅菌脱イオン水に再懸濁し、２つの１．５ｍｌスクリュートップマイクロキャップに等分した。 チューブを沸騰水浴に１０分間入れることにより、生物からＤＮＡを抽出した。 ライセートを等量のフェノール: クロロホルム: イソアミルアルコール (25:24:1; v/v/v) と 5 分間混合しました。 遠心分離（１３０００ｒｐｍ、１０分）後、各調製物からの水性上相を新しい試験管に移し、１容量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）と５分間混合した。 遠心分離（１３０００ｒｐｍ、１０分）後、各調製物からの水性上相を新しい試験管に移し、０．１容量の４．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．４）および２容量のエタノールを添加した。 -20℃で一晩、DNAを沈殿させた。 ＤＮＡを遠心分離（１３０００ｒｐｍ、１０分）によってペレット化し、１ｍＬの７０％エタノール、９５％エタノールで順次洗浄し、ほぼ乾燥させた。 次いで、ＤＮＡを１００μｌの水に溶解した。 核酸の濃度と純度は、260ナノメートルの波長で測定され、260ナノメートルと280ナノメートルでの吸光度の比は、分光光度計で滅菌石英キュベットを使用して測定されました。

TaqMan システム (Yoshida et al., 2003) を使用したリアルタイム PCR アッセイは、舌コーティング中の F. nucleatum および P. gingivalis の 16S rRNA の定量分析のための現在の研究で使用されました。 サンプルのライセートは、圧力の上昇を防ぐために細い無菌針でキャップに穴を開けた後、アリコートを 10 分間煮沸することによって調製しました。 ＰＣＲは、Ｌｉｇｈｔ ＣｙｃｌｅｒＴＭ Ｆａｓｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、５００ｎＭのセンスおよびアンチセンスプライマー、２００ｎＭのプローブおよび５μｌの溶解細胞を使用して、総量２０μｌで実施した。 使用した種特異的プライマーと TaqMan プローブを表 1 に示します。 増幅産物の特異性、したがってプライマーの特異性は、以前に確認されています (Kato et al., 2005; Yoshida et al., 2003)。 増幅および検出は、LightCycler Sequence Detection System (Roche Diagnostics、マンハイム、ドイツ) を使用して、次のサイクル条件で実行しました。両方のアッセイで同一です: 95℃ 10 分間、その後 95℃ 10 秒間、58℃ 25 秒間の 45 サイクル、および最終伸長。 40℃で30秒。 標準曲線は、各試験生物の既知量の精製ゲノム DNA の連続希釈を使用して、各アッセイについてプロットしました。

統計的方法:

ロジスティック回帰によって、非喫煙者の口臭の検出 (存在または不在) と歯周状態との間に関連性がないという統計的帰無仮説をテストしました。 各臨床グループのサイズは 20 を超え、臨床グループあたりの口臭陽性被験者の最小数は健康なグループ (9 人の口臭陽性被験者) を除いて 10 を超えていたため、サンプルサイズはこの統計の適用に適切であると見なされました。モデル (Peduzzi et al. 1996)。

ロジスティック回帰を用いて、口臭の有無と臨床指標（PI、CPD、CAL、BOP、部位＞5mm CPD、WTCI）との関連を調べた。 スピアマンのロー相関係数は、スケール変数間の関連性と、2 人の臭気評価者のスコア間の一致を推定しました。 スケール変数の正規性の仮定は、Shapiro Wilk 検定によってテストされました。 グループ間の比較は、クラスカル-ワリス検定を使用して実行されましたが、ペアワイズ比較は、ボンフェローニのタイプIエラーの調整を使用したマン-ホイットニー検定によって実行されました。

データの分析は SPSS バージョン 16.0 ソフトウェアを使用して実行され、統計的有意性のレベルは p<0.05 に設定されました。