口腔异味和牙周病相关参数

文献中存在关于牙周炎是否与口腔异味有关的争论，本研究试图了解牙周病与口腔异味相关参数的关联方式。

临床方案：

希腊塞萨洛尼基亚里士多德大学牙周病学系对 78 名全身健康的非吸烟者进行了口腔口臭筛查。 这些是无口臭主诉的受试者。 在初步筛选适用性并获得塞萨洛尼基亚里士多德大学牙科学院伦理委员会批准的签署知情同意书后，记录全口牙周图表，包括牙菌斑指数 (PI)、临床探诊深度 (CPD)、临床附着度使用手动牙周探针 (Hu-Friedy XP-23/QW) 在每颗牙齿的六个部位进行水平 (CAL) 和探诊出血 (BOP)。 符合临床纳入标准的受试者被分类为慢性牙周炎（N=28）、慢性全身性牙龈炎（N=23）或健康个体（27），并进一步进行临床和微生物监测。

舌苔评估：

温克尔舌苔指数 (Winkel et al., 2003) 是通过将舌背分成六分仪来视觉确定的。 根据存款的数量，每个六分仪的分数介于 0 和 2 之间，将这些分数相加得到从 0 到 12 的总分。

舌样采集：

从舌背后部采集标本，通过实时 PCR 对两种假定的牙周病原体牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌进行定量分析。

为了避免探诊出血和舌头取样对感官评估的干扰，主要是对舌头气味的评估，受试者在一天的同一时间和四天内的第二次就诊时因口腔异味而被召回评估。 在这个较短的时间间隔内，参与者被要求不要改变他们的日常饮食和口腔卫生习惯，除非在下次访问前 48 小时进行口臭评估（Roldán 等人，2003 年；Donaldson 等人，2007 年） . 向每位参与者提供了有关食物和饮料消费以及口腔卫生习惯的书面说明。 更详细地说，检查前 48 天避免了辛辣食物、洋葱、大蒜、酒精和漱口水。 在评估的早晨，避免使用咖啡、薄荷糖、口香糖、口腔卫生习惯、香味化妆品或须后水。 在气味评估之前至少两小时允许用水和用水漱口。 以类似的方式，进行口臭感官评估的法官在进行检查前 24 小时遵循与参与者相同的指示。

口臭评估：

• Halimeter®（Halimeter® RH-17，Interscan Corporation，查茨沃斯，加利福尼亚州，美国）用于测量挥发性硫化物 (VSC) 的浓度，单位为十亿分之一 (p.p.b.)（Rosenberg 等人，1991 年）。 评估总是在 10.00-12.00 之间在诊所的同一张牙科椅上进行，以尽量减少房间温度和湿度的每日变化（Liu 等人，2006 年）；
• 从零到五的感官评估 (ORG)（Rosenberg 等人，1991 年）评估了以下参数的气味：

全口空气 (ORG1) - 受试者被要求通过屏幕轻轻地呼气到一个 20 厘米长的管子中，以避免与气味法官的目光接触，气味法官在管子的另一端评估呼吸气味（Murata 等人，2002 年） ;舌背前区 (ORG2) - 受试者被要求舔他们的手腕并等待几秒钟，让该区域变干，然后再评估气味；舌后区 (ORG3) - 使用塑料勺以标准化方式从舌背后部采集材料；鼻气——受试者被要求在用手指盖住另一鼻孔后通过一个鼻孔呼气，以排除可能与口臭有关的口腔外原因。

一位经过校准的单一“检查员”记录牙周测量值和 Halimeter® 读数，而一位经过校准的“法官”进行口臭的感官评估。 所有参与者均由同一考官和法官进行评估。 为了确保公正的数据收集，气味判断者对 Halimeter® 测量和个体的临床状态不知情。 在此调查之前和期间，气味判断器和额外的气味“评估器”针对范围广泛的正丁醇溶液反复标准化，强度从百万分之 25 到 6075（Nachnani 等人，2005 年；Saad 等人， 2005) 以及牙周诊所患者的口腔异味。 为了评估评委评分的可靠性，评委和评估员检查了一些研究参与者的口腔气味，但并没有意识到彼此的分数。 在分数之间发现了统计学上显着的相关性（Spearman 的 rho = 0.64 对于整个口腔空气的气味，p < 0.001）（S.A.C.M.O.T.，2002）。 需要注意的是，在数据分析中只使用了法官的评价。

当整个口腔空气的感官评分为 2 或更高，和/或 Halimeter® 的读数超过 140 p.p.b 时，受试者被指定为口臭阳性 (+)。

实时聚合酶链反应：

牙龈卟啉单胞菌菌株 W50 和具核梭菌菌株 ATCC 10953 的 DNA 是在格拉斯哥大学牙科学院按照标准方案制备的。 简而言之，P. gingivalis 和 F. nucleatum 在苛刻的厌氧菌琼脂上生长，并在 3 到 7 天后收获。 用拭子从单个琼脂平板上收集生物体，并分散到含有 0.1mM EDTA 二钠 (PBSE) 的 PBS 中。 在 PBS 中洗涤一次后，将它们重新悬浮在 1ml 无菌去离子水中，并等分到两个 1.5ml 螺旋盖微帽中。 通过将试管放入沸水浴中十分钟，从生物体中提取 DNA。 将裂解物与等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1；v/v/v）混合 5 分钟。 离心（13000rpm，10 分钟）后，将每个制备物的上层水相转移到新试管中，并与一体积的氯仿：异戊醇（24：1）混合 5 分钟。 离心（13000 rpm，10 分钟）后，将来自每个制备物的水性上层相转移至新试管中并加入 0.1 体积的 4.5M 乙酸钠溶液（pH 5.4）和两倍体积的乙醇。 DNA 在-20oC 下沉淀过夜。 通过离心（13000rpm，10 分钟）沉淀 DNA，依次在 1mL 的 70% 乙醇、95% 乙醇中洗涤并使其几乎干燥。 然后将 DNA 溶解在 100 微升水中。 在 260 纳米的波长下测量核酸浓度和纯度，并在分光光度计中使用无菌石英比色皿测量 260 和 280 纳米处的吸光度比。

本研究使用 TaqMan 系统（Yoshida 等人，2003 年）进行实时 PCR 分析，对舌苔中具核梭菌和牙龈卟啉单胞菌的 16S rRNA 进行定量分析。 在用细无菌针刺破盖子以防止压力增加后，通过将等分试样煮沸 10 分钟来制备样品的裂解物。 使用 Light CyclerTM Fast Start DNA Master Hybridization Probes 试剂盒（Roche Diagnostics, Manheim, Germany）以 20 μl 的总体积进行 PCR，有义和反义引物各 500nM，200nM 探针和 5μl 裂解细胞。 使用的物种特异性引物和 TaqMan 探针如表 1 所示。 扩增产物的特异性以及引物的特异性先前已得到证实（Kato 等人，2005 年；Yoshida 等人，2003 年）。 使用 LightCycler 序列检测系统（Roche Diagnostics, Manheim, Germany）进行扩增和检测，循环条件如下，两种测定相同：95°C 10 分钟，然后 95°C 10 秒、58°C 25 秒和最终延伸 45 个循环40℃ 30 秒。 通过使用每个测试生物体的已知量的纯化基因组 DNA 的连续稀释，为每个测定绘制标准曲线。

统计方法：

通过逻辑回归检验了非吸烟受试者的口臭检测（存在或不存在）与牙周状态之间没有关联的统计零假设。 由于每个临床组的人数都在 20 人以上，并且每个临床组的口臭阳性受试者的最少人数超过 10 人，除了健康组（9 名口臭阳性受试者）外，样本量被认为足以应用此统计数据模型（Peduzzi 等人，1996 年）。

使用逻辑回归检查是否存在口臭与临床指标（PI、CPD、CAL、BOP、位点 > 5mm CPD、WTCI）之间的关联。 Spearman 的 rho 相关系数估计了尺度变量之间的关联以及两个气味评估员的分数之间的一致性。 Shapiro Wilk 检验对尺度变量的正态性假设进行了检验。 使用 Kruskal-Wallis 检验进行组间比较，而使用 Bonferroni 调整 I 类错误的 Mann-Whitney 检验进行成对比较。

数据分析采用SPSS 16.0版软件，统计显着性水平设定为p<0.05。