Mau cheiro bucal e parâmetros relacionados à doença periodontal

Existe um debate na literatura sobre se a periodontite está ligada ao mau hálito e este estudo tenta entender a maneira pela qual a doença periodontal está associada aos parâmetros relacionados ao mau hálito.

Protocolo clínico:

Setenta e oito não fumantes sistemicamente saudáveis ​​foram rastreados para halitose oral no Departamento de Periodontologia, Universidade Aristóteles de Thessaloniki, Grécia. Estes eram indivíduos com queixas de não halitose. Após a triagem inicial para adequação e obtenção de um consentimento informado assinado aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Odontologia, Universidade Aristóteles de Thessaloniki, um gráfico periodontal de toda a boca foi registrado, incluindo índice de placa (PI), profundidade de sondagem clínica (CPD), inserção clínica níveis (CAL) e sangramento à sondagem (BOP) em seis locais por dente usando uma sonda periodontal manual (Hu-Friedy XP-23/QW). Os indivíduos que preencheram os critérios de inclusão clínica foram classificados como periodontite crônica (N=28), gengivite crônica generalizada (N=23) ou indivíduos saudáveis ​​(27) e foram posteriormente monitorados clínica e microbiologicamente.

Avaliação da saburra lingual:

O Winkel Tongue Coating Index (Winkel et al., 2003) foi determinado visualmente dividindo o dorso da língua em sextantes. A cada sextante foi dada uma pontuação entre zero e dois de acordo com a quantidade de depósitos e essas pontuações foram somadas dando um total variando de zero a 12.

Coleta de amostra de língua:

Um espécime foi coletado da parte posterior do dorso da língua para análise quantitativa de dois patógenos periodontais putativos, Porphyromonas gingivalis e Fusobacterium nucleatum, por PCR em tempo real.

A fim de evitar a interferência do sangramento na sondagem e na amostragem da língua com as avaliações organolépticas e principalmente com a avaliação do odor da língua, os indivíduos foram convocados em uma segunda visita na mesma hora do dia e dentro de um período de quatro dias para mau hálito avaliação. Nesse curto intervalo de tempo, foi solicitado aos participantes que não mudassem seus hábitos alimentares e de higiene oral de rotina, exceto 48 horas antes da próxima visita, quando as avaliações de halitose foram realizadas (Roldán et al., 2003; Donaldson et al., 2007). . Instruções escritas foram dadas a cada participante sobre o consumo de alimentos e bebidas e hábitos de higiene oral. Mais detalhadamente, alimentos condimentados, cebola, alho, álcool e enxaguatórios bucais foram evitados 48 antes do exame. Na manhã da avaliação, café, balas, chicletes, práticas de higiene bucal, cosméticos perfumados ou loção pós-barba foram evitados. O consumo de água e bochechos com água foram permitidos pelo menos duas horas antes da avaliação do odor. Da mesma forma, o juiz que realizou as avaliações organolépticas do odor oral seguiu as mesmas instruções dos participantes por 24 horas antes da realização dos exames.

Avaliação do mau hálito:

• O Halimeter® (Halimeter® RH-17, Interscan Corporation, Chatsworth, CA, EUA) foi usado para medir a concentração de compostos voláteis de sulfeto (VSC) em partes por bilhão (p.p.b.) (Rosenberg et al., 1991). As avaliações foram sempre realizadas entre 10h00 e 12h00 na mesma cadeira odontológica da clínica para minimizar a variabilidade diária na temperatura e umidade da sala (Liu et al., 2006);
• Avaliações organolépticas (ORG) variando de zero a cinco (Rosenberg et al., 1991) avaliaram o odor dos seguintes parâmetros:

Ar de boca inteira (ORG1) - os indivíduos foram solicitados a expirar suavemente em um tubo de 20 cm de comprimento por meio de uma tela, para evitar contato visual com o juiz de odor, que avaliou o odor do hálito na outra extremidade do tubo (Murata et al., 2002) ; Região anterior do dorso da língua (ORG2) - os sujeitos foram solicitados a lamber os punhos e esperar alguns segundos para permitir que a área secasse antes de avaliar o odor; Região posterior da língua (ORG3) - o material foi colhido da parte posterior do dorso lingual de forma padronizada com colher de plástico; Ar nasal - os indivíduos foram solicitados a expirar por uma narina após tampar a narina oposta com o dedo, a fim de excluir causas extra-orais que possam estar relacionadas ao mau hálito.

Um único "examinador" calibrado registrou as medidas periodontais e as leituras do Halimeter®, enquanto um "juiz" calibrado realizou as avaliações organolépticas da halitose. Todos os participantes foram avaliados pelo mesmo examinador e juiz. Para garantir a coleta de dados imparcial, o juiz de odores era cego em relação às medições do Halimeter® e ao estado clínico do indivíduo. Antes e durante esta investigação, o juiz de odor e um "avaliador" de odor adicional foram repetidamente padronizados contra uma ampla gama de soluções de n-butanol com intensidades de 25 a 6075 partes por milhão (Nachnani et al., 2005; Saad et al., 2005) e também no odor bucal de pacientes atendidos na clínica periodontal. A fim de avaliar a confiabilidade das classificações do juiz, o juiz e o avaliador examinaram o odor bucal de vários participantes do estudo sem estarem cientes da pontuação um do outro. Uma correlação estatisticamente significativa foi encontrada entre os escores (Spearman's rho=0,64 para o odor de boca inteira, p<0,001) (S.A.C.M.O.T., 2002). Deve-se notar que apenas as avaliações do juiz foram utilizadas na análise dos dados.

Os indivíduos foram designados como positivos para halitose (+) quando a pontuação organoléptica de todo o ar da boca era dois ou mais e/ou as leituras do Halimeter® excediam 140 p.p.b.

Reação em cadeia da polimerase em tempo real:

O DNA da cepa P. gingivalis W50 e da cepa F. nucleatum ATCC 10953 foi preparado na Dental School, University of Glasgow seguindo o protocolo padrão. Resumidamente, P. gingivalis e F. nucleatum foram cultivados em ágar anaeróbio exigente e colhidos após três a sete dias. Os organismos de uma única placa de ágar foram colhidos com zaragatoas e dispersos em PBS contendo 0,1 mM de EDTA dissódico (PBSE). Após uma lavagem em PBS, eles foram ressuspensos em 1 ml de água deionizada estéril e aliquotados em duas microcápsulas de 1,5 ml com tampa de rosca. O DNA foi extraído dos organismos colocando os tubos em banho-maria fervente por dez minutos. O lisado foi misturado com igual volume de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1; v/v/v) por cinco minutos. Após centrifugação (13000rpm, 10min) a fase superior aquosa de cada preparação foi transferida para um tubo novo e misturada com um volume de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) por cinco minutos. Após centrifugação (13000rpm, 10min) a fase superior aquosa de cada preparação foi transferida para um tubo fresco e 0,1 volume de solução de acetato de sódio 4,5M (pH 5,4) e dois volumes de etanol foram adicionados. O DNA foi precipitado durante a noite a -20oC. O DNA foi peletizado por centrifugação (13000rpm, 10min) lavado sequencialmente em 1mL de etanol 70%, etanol 95% e deixado quase secar. O DNA foi então dissolvido em 100 µl de água. A concentração e a pureza do ácido nucleico foram medidas em um comprimento de onda de 260 nanômetros e a proporção da absorbância em 260 e 280 nanômetros foi medida usando uma cubeta de quartzo estéril em um espectrofotômetro.

Um ensaio de PCR em tempo real usando o sistema TaqMan (Yoshida et al., 2003) foi usado no presente estudo para a análise quantitativa do 16S rRNA de F. nucleatum e P. gingivalis em saburra lingual. Os lisados ​​das amostras foram preparados fervendo a alíquota por 10 minutos após perfurar a tampa com uma agulha estéril fina para evitar o acúmulo de pressão. A PCR foi realizada em um volume total de 20μl usando o kit Light CyclerTM Fast Start DNA Master Hybridization Probes (Roche Diagnostics, Manheim, Alemanha), 500nM cada de primers sentido e antisense, sonda 200nM e 5μl de células lisadas. Os primers específicos da espécie e as sondas TaqMan usadas são mostradas na Tabela 1. A especificidade dos produtos amplificados e, portanto, dos primers foi confirmada anteriormente (Kato et al., 2005; Yoshida et al., 2003). A amplificação e detecção foram realizadas com o LightCycler Sequence Detection System (Roche Diagnostics, Manheim, Alemanha) com as seguintes condições de ciclo, idênticas para ambos os ensaios: 95C por 10min, e então 45 ciclos de 95C por 10 seg, 58C por 25 seg e um alongamento final a 40C por 30 seg. Uma curva padrão foi traçada para cada ensaio usando diluições em série de quantidades conhecidas de DNA genômico purificado de cada organismo de teste.

Métodos estatísticos:

A hipótese estatística nula de que não há associação entre a detecção de halitose (presença ou ausência) e o estado periodontal em indivíduos não fumantes foi testada por regressão logística. Como o tamanho de cada grupo clínico era superior a 20 e o número mínimo de indivíduos positivos para halitose por grupo clínico ultrapassava dez, com exceção do grupo saudável (nove indivíduos positivos para halitose), o tamanho da amostra foi considerado adequado para a aplicação desta estatística modelo (Peduzzi et al. 1996).

A associação entre a presença ou ausência de halitose e os índices clínicos (PI, CPD, CAL, BOP, locais > 5mm CPD, WTCI) foi examinada por meio de regressão logística. O coeficiente de correlação rho de Spearman estimou a associação entre as variáveis ​​da escala e também a concordância entre as pontuações dos dois avaliadores de odor. A suposição de normalidade para as variáveis ​​da escala foi testada pelo teste de Shapiro Wilk. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Kruskal-Wallis, enquanto as comparações pareadas foram feitas pelo teste de Mann-Whitney com ajuste de erro tipo I de Bonferroni.

A análise dos dados foi realizada por meio do software SPSS versão 16.0 e o nível de significância estatística adotado foi p<0,05.