Nieprzyjemny zapach z ust i parametry związane z chorobami przyzębia

W literaturze toczy się debata na temat tego, czy zapalenie przyzębia jest powiązane z nieprzyjemnym zapachem z ust, a niniejsze badanie ma na celu zrozumienie, w jaki sposób choroba przyzębia jest powiązana z parametrami związanymi z nieprzyjemnym zapachem z ust.

Protokół kliniczny:

Siedemdziesięciu ośmiu zdrowych układowo osób niepalących zostało przebadanych pod kątem cuchnącego oddechu w Zakładzie Periodontologii Uniwersytetu Arystotelesa w Salonikach w Grecji. Były to osoby nieskarżące na cuchnący oddech. Po wstępnej selekcji pod kątem przydatności i uzyskaniu podpisanej świadomej zgody zatwierdzonej przez Komisję Etyki Szkoły Stomatologicznej Uniwersytetu im. Arystotelesa w Salonikach, sporządzono kartę periodontologiczną całej jamy ustnej, w tym wskaźnik płytki nazębnej (PI), kliniczną głębokość sondowania (CPD), przyczep kliniczny poziomów (CAL) i krwawienia podczas sondowania (BOP) w sześciu miejscach na ząb przy użyciu ręcznej sondy periodontologicznej (Hu-Friedy XP-23/QW). Osoby, które spełniły kliniczne kryteria włączenia, zostały sklasyfikowane jako z przewlekłym zapaleniem przyzębia (N=28), przewlekłym uogólnionym zapaleniem dziąseł (N=23) lub osoby zdrowe (27) i były dalej monitorowane klinicznie i mikrobiologicznie.

Ocena powłoki języka:

Winkel Tongue Coating Index (Winkel et al., 2003) określono wizualnie, dzieląc grzbiet języka na sekstanty. Punktacja od zera do dwóch została przyznana każdemu sekstansowi w zależności od ilości depozytów, a wyniki te zostały dodane, dając sumę w zakresie od zera do 12.

Pobranie próbki języka:

Próbkę pobrano z tylnej części grzbietu języka w celu analizy ilościowej dwóch domniemanych patogenów przyzębia, Porphyromonas gingivalis i Fusobacterium nucleatum, metodą PCR w czasie rzeczywistym.

Aby uniknąć interferencji krwawienia podczas sondowania i pobierania próbek z języka z ocenami organoleptycznymi, a przede wszystkim z oceną zapachu języka, osoby badane zgłaszano na drugą wizytę o tej samej porze dnia i w okresie czterech dni z powodu nieprzyjemnego zapachu z ust ocena. W tym krótkim przedziale czasu uczestników poproszono, aby nie zmieniali swoich rutynowych nawyków żywieniowych i higieny jamy ustnej, z wyjątkiem 48 godzin przed kolejną wizytą, kiedy przeprowadzano oceny cuchnącego oddechu (Roldán i in., 2003; Donaldson i in., 2007). . Każdemu uczestnikowi przekazano pisemne instrukcje dotyczące spożywania żywności i napojów oraz nawyków higieny jamy ustnej. Bardziej szczegółowo, unikano ostrych potraw, cebuli, czosnku, alkoholu i płynów do płukania ust 48 przed badaniem. Rano w dniu oceny unikano kawy, miętówek, gumy do żucia, higieny jamy ustnej, kosmetyków zapachowych czy płynu po goleniu. Spożywanie wody i płukanie jamy ustnej wodą było dozwolone co najmniej dwie godziny przed oceną zapachu. W podobny sposób sędzia dokonujący oceny organoleptycznej nieprzyjemnego zapachu z ust stosował się do tych samych instrukcji co uczestnicy przez 24 godziny przed przystąpieniem do badań.

Ocena nieprzyjemnego zapachu z ust:

• Halimeter® (Halimeter® RH-17, Interscan Corporation, Chatsworth, CA, USA) zastosowano do pomiaru stężenia lotnych związków siarczkowych (VSC) w częściach na miliard (ppb) (Rosenberg i in., 1991). Oceny przeprowadzano zawsze w godzinach 10.00-12.00 na tym samym fotelu dentystycznym w klinice, aby zminimalizować dobową zmienność temperatury i wilgotności w pomieszczeniu (Liu i in., 2006);
• Oceny organoleptyczne (ORG) w zakresie od zera do pięciu (Rosenberg i in., 1991) oceniały zapach następujących parametrów:

Powietrze z całej jamy ustnej (ORG1) — badani zostali poproszeni o delikatne wydychanie przez ekran do rurki o długości 20 cm, aby uniknąć kontaktu wzrokowego z sędzią zapachu, który oceniał zapach oddechu na drugim końcu rurki (Murata i in., 2002) ; Przedni obszar grzbietu języka (ORG2) - osoby badane proszono o polizanie nadgarstków i odczekanie kilku sekund, aby obszar wyschnął przed oceną zapachu; Rejon tylny języka (ORG3) – materiał pobrano z tylnej części grzbietu języka w znormalizowany sposób za pomocą plastikowej łyżki; Powietrze przez nos — osoby badane proszono o wydychanie przez jedno nozdrze po zatkaniu palcem drugiego nozdrza w celu wykluczenia pozaustnych przyczyn, które mogą być związane z nieświeżym oddechem.

Skalibrowany pojedynczy „egzaminator” rejestrował pomiary periodontologiczne i odczyty Halimeter®, podczas gdy jeden skalibrowany „sędzia” przeprowadzał oceny organoleptyczne cuchnącego oddechu. Wszyscy uczestnicy byli oceniani przez tego samego egzaminatora i sędziego. Aby zapewnić bezstronne gromadzenie danych, sędzia zapachowy był zaślepiony w odniesieniu do pomiarów Halimeter® i stanu klinicznego danej osoby. Przed i podczas tego badania sędzia zapachowy i dodatkowy „oceniający zapach” były wielokrotnie standaryzowane względem szerokiej gamy roztworów n-butanolu o intensywności od 25 do 6075 części na milion (Nachnani i in., 2005; Saad i in., 2005), a także na zapach z ust pacjentów zgłaszających się do poradni periodontologicznej. Aby ocenić wiarygodność ocen sędziego, sędzia i osoba oceniająca zbadali zapach ust pewnej liczby uczestników badania, nie znając nawzajem swojego wyniku. Stwierdzono statystycznie istotną korelację pomiędzy wynikami (rho Spearmana = 0,64 dla zapachu całego powietrza w jamie ustnej, p<0,001) (S.A.C.M.O.T., 2002). Należy zauważyć, że w analizie danych wykorzystano wyłącznie oceny sędziego.

Osobników określano jako dodatnich pod względem cuchnącego oddechu (+), gdy ocena organoleptyczna całego powietrza w jamie ustnej wynosiła dwa lub więcej i/lub odczyty Halimeter® przekraczały 140 p.b.

Reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym:

DNA szczepu W50 P. gingivalis i szczepu F. nucleatum ATCC 10953 przygotowano w Dental School Uniwersytetu Glasgow zgodnie ze standardowym protokołem. W skrócie, P. gingivalis i F. nucleatum hodowano na wymagającym agarze beztlenowym i zbierano po trzech do siedmiu dniach. Organizmy z pojedynczej płytki agarowej zebrano za pomocą wacików i zdyspergowano w PBS zawierającym 0,1 mM disodowy EDTA (PBSE). Po jednym przemyciu w PBS zawieszono je ponownie w 1 ml sterylnej dejonizowanej wody i podzielono na porcje do dwóch 1,5 ml zakręcanych mikronakrętek. DNA ekstrahowano z organizmów przez umieszczenie probówek we wrzącej łaźni wodnej na dziesięć minut. Lizat mieszano z równą objętością fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego (25:24:1; obj./obj./obj.) przez pięć minut. Po odwirowaniu (13000 obr./min, 10 min) wodną górną fazę z każdego preparatu przeniesiono do świeżej probówki i mieszano z jedną objętością mieszaniny chloroform: alkohol izoamylowy (24:1) przez pięć minut. Po odwirowaniu (13000 obr./min, 10 min) górną fazę wodną z każdego preparatu przeniesiono do świeżej probówki i dodano 0,1 objętości 4,5 M roztworu octanu sodu (pH 5,4) i dwie objętości etanolu. DNA wytrącano przez noc w temperaturze -20oC. DNA osadzono przez wirowanie (13000 obrotów na minutę, 10 minut), przemyto kolejno w 1 ml 70% etanolu, 95% etanolu i pozostawiono do prawie wyschnięcia. Następnie DNA rozpuszczono w 100 ul wody. Stężenie i czystość kwasu nukleinowego mierzono przy długości fali 260 nanometrów, a stosunek absorbancji przy 260 i 280 nanometrach mierzono za pomocą sterylnej kuwety kwarcowej w spektrofotometrze.

Test PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu systemu TaqMan (Yoshida i in., 2003) został wykorzystany w bieżącym badaniu do ilościowej analizy 16S rRNA F. nucleatum i P. gingivalis w powłokach języka. Lizaty próbek przygotowano przez gotowanie podwielokrotności przez 10 minut po nakłuciu nasadki cienką sterylną igłą, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia. PCR przeprowadzono przy całkowitej objętości 20 μl przy użyciu zestawu Light CyclerTM Fast Start DNA Master Hybridization Probes (Roche Diagnostics, Manheim, Niemcy), 500 nM starterów sensownych i antysensownych, 200 nM sondy i 5 μl zlizowanych komórek. Zastosowane startery specyficzne dla gatunku i sondy TaqMan przedstawiono w tabeli 1. Specyficzność zamplifikowanych produktów, a zatem starterów, została potwierdzona wcześniej (Kato i in., 2005; Yoshida i in., 2003). Amplifikację i detekcję przeprowadzono za pomocą systemu LightCycler Sequence Detection System (Roche Diagnostics, Manheim, Niemcy) w następujących warunkach cyklu, identycznych dla obu testów: 95°C przez 10 min, a następnie 45 cykli 95°C przez 10 s, 58°C przez 25 s i końcowe wydłużenie w 40°C przez 30 sek. Dla każdego testu wykreślono krzywą standardową, stosując seryjne rozcieńczenia znanych ilości oczyszczonego genomowego DNA każdego organizmu testowego.

Metody statystyczne:

Statystyczna hipoteza zerowa, że ​​nie ma związku między wykryciem cuchnącego oddechu (obecnością lub brakiem) a stanem przyzębia u osób niepalących, została przetestowana za pomocą regresji logistycznej. Ponieważ wielkość każdej grupy klinicznej przekraczała 20 osób, a minimalna liczba osób z cuchnącym oddechem na grupę kliniczną przekraczała dziesięć, z wyjątkiem grupy zdrowej (dziewięć osób z cuchnącym oddechem), wielkość próby uznano za odpowiednią do zastosowania tego statystycznego modelu (Peduzzi i in. 1996).

Związek między obecnością lub brakiem cuchnącego oddechu a wskaźnikami klinicznymi (PI, CPD, CAL, BOP, miejsca > 5 mm CPD, WTCI) zbadano za pomocą regresji logistycznej. Współczynnik korelacji rho Spearmana oszacował związek między zmiennymi skali, a także zgodność między wynikami dwóch oceniających zapach. Założenie o normalności zmiennych ilościowych zostało sprawdzone testem Shapiro Wilka. Porównania międzygrupowe wykonano testem Kruskala-Wallisa, natomiast porównania parami przeprowadzono testem Manna-Whitneya z poprawką Bonferroniego błędu I rodzaju.

Analizę danych przeprowadzono za pomocą oprogramowania SPSS w wersji 16.0, a poziom istotności statystycznej ustalono na p<0,05.