Параметры, связанные с неприятным запахом изо рта и заболеваниями пародонта

В литературе ведутся споры о том, связан ли пародонтит с неприятным запахом изо рта, и в этом исследовании делается попытка понять, как заболевание пародонта связано с параметрами, связанными с неприятным запахом изо рта.

Клинический протокол:

Семьдесят восемь системно здоровых некурящих были обследованы на неприятный запах изо рта в отделении пародонтологии Университета Аристотеля в Салониках, Греция. Это были субъекты, не жалующиеся на неприятный запах изо рта. После первоначального скрининга на пригодность и получения подписанного информированного согласия, одобренного Комитетом по этике Стоматологической школы Университета Аристотеля в Салониках, была записана пародонтальная карта всего рта, включая индекс зубного налета (PI), глубину клинического зондирования (CPD), клиническое прилегание. уровни (CAL) и кровотечение при зондировании (BOP) в шести местах на зуб с использованием ручного пародонтального зонда (Hu-Friedy XP-23/QW). Субъекты, которые соответствовали клиническим критериям включения, были классифицированы как хронический пародонтит (N = 28), хронический генерализованный гингивит (N = 23) или здоровые люди (27) и подвергались дальнейшему клиническому и микробиологическому мониторингу.

Оценка налета на языке:

Индекс покрытия языка Винкеля (Winkel et al., 2003) определяли визуально, разделяя спинку языка на секстанты. Каждому секстанту присваивался балл от нуля до двух в соответствии с количеством депозитов, и эти баллы складывались, давая общее количество баллов от нуля до 12.

Сбор образца языка:

Образец был взят с задней части спинки языка для количественного анализа двух предполагаемых пародонтологических патогенов, Porphyromonas gingivalis и Fusobacterium nucleatum, с помощью ПЦР в реальном времени.

Чтобы избежать влияния кровотечения при зондировании и взятии проб языка на органолептические оценки и, в первую очередь, на оценку запаха языка, испытуемых вызывали во время второго визита в то же время дня и в течение четырех дней в случае неприятного запаха изо рта. оценка. В течение этого короткого промежутка времени участников просили не менять свои обычные привычки питания и гигиены полости рта, за исключением 48 часов до следующего визита, когда проводилась оценка неприятного запаха изо рта (Roldan et al., 2003; Donaldson et al., 2007). . Каждому участнику были даны письменные инструкции относительно потребления пищи и напитков и привычек гигиены полости рта. Более подробно, перед обследованием избегали острой пищи, лука, чеснока, алкоголя и ополаскивателей для рта. На утро оценки избегали кофе, мятных конфет, жевательной резинки, практики гигиены полости рта, ароматизированной косметики или лосьона после бритья. Потребление воды и полоскание рта водой разрешалось не менее чем за два часа до оценки запаха. Аналогичным образом судья, проводивший органолептические оценки неприятного запаха изо рта, следовал тем же инструкциям, что и участники, в течение 24 часов перед проведением исследований.

Оценка неприятного запаха изо рта:

• Halimeter® (Halimeter® RH-17, Interscan Corporation, Chatsworth, CA, USA) использовали для измерения концентрации летучих сульфидных соединений (VSC) в частях на миллиард (ppb) (Rosenberg et al., 1991). Оценки всегда проводились между 10.00-12.00 на одном и том же стоматологическом кресле в клинике, чтобы свести к минимуму ежедневные колебания температуры и влажности в помещении (Liu et al., 2006);
• Органолептические оценки (ORG) от нуля до пяти (Rosenberg et al., 1991) оценивали запах по следующим параметрам:

Воздух всего рта (ORG1) — испытуемых просили осторожно выдохнуть в трубку длиной 20 см через экран, чтобы избежать зрительного контакта с судьей по запаху, который оценивал запах изо рта на другом конце трубки (Murata et al., 2002). ; Передняя область спинки языка (ORG2) — испытуемых просили лизнуть запястья и подождать пару секунд, чтобы область высохла, прежде чем оценивать запах; Задняя область языка (ORG3) – материал собирали с задней поверхности спинки языка стандартизированным способом пластиковой ложкой; Носовой воздух: испытуемых просили выдохнуть через одну ноздрю, закрыв противоположную ноздрю пальцем, чтобы исключить внеротовые причины, которые могут быть связаны с неприятным запахом изо рта.

Откалиброванный один «исследователь» записывал периодонтальные измерения и показания Halimeter®, тогда как один откалиброванный «судья» проводил органолептические оценки неприятного запаха изо рта. Все участники оценивались одним и тем же экзаменатором и судьей. Чтобы обеспечить беспристрастный сбор данных, судья по запаху был ослеплен в отношении измерений Halimeter® и клинического состояния человека. До и во время этого исследования оценщик запаха и дополнительный «оценщик» запаха неоднократно стандартизировались по широкому диапазону растворов н-бутанола с интенсивностью от 25 до 6075 частей на миллион (Nachnani et al., 2005; Saad et al., 2005), а также на запах изо рта у пациентов, обращающихся в пародонтологическую клинику. Чтобы оценить надежность судейских оценок, судья и оценщик изучили запах изо рта ряда участников исследования, не зная оценок друг друга. Между оценками была обнаружена статистически значимая корреляция (коэффициент Спирмена rho=0,64 для запаха всего воздуха во рту, p<0,001) (S.A.C.M.O.T., 2002). Следует отметить, что при анализе данных использовались только оценки судей.

Субъекты считались положительными (+), если органолептическая оценка всего воздуха изо рта равнялась двум или более и/или показания прибора Halimeter® превышали 140 частей на миллиард.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени:

ДНК штамма P. gingivalis W50 и штамма F. nucleatum ATCC 10953 получали в Стоматологической школе Университета Глазго в соответствии со стандартным протоколом. Вкратце, P. gingivalis и F. nucleatum выращивали на прихотливом анаэробном агаре и собирали через три-семь дней. Организмы с одной чашки с агаром собирали тампонами и диспергировали в PBS, содержащем 0,1 мМ динатрий ЭДТА (PBSE). После одной промывки в PBS их ресуспендировали в 1 мл стерильной деионизированной воды и разделяли на аликвоты на две микрокапсулы с завинчивающейся крышкой объемом 1,5 мл. ДНК выделяли из организмов, помещая пробирки в кипящую водяную баню на десять минут. Лизат смешивали с равным объемом фенола: хлороформа: изоамилового спирта (25:24:1; об./об./об.) в течение пяти минут. После центрифугирования (13000 об/мин, 10 мин) водную верхнюю фазу из каждого препарата переносили в свежую пробирку и смешивали с одним объемом хлороформа:изоамилового спирта (24:1) в течение пяти минут. После центрифугирования (13000 об/мин, 10 мин) водную верхнюю фазу из каждого препарата переносили в свежую пробирку и добавляли 0,1 объема 4,5 М раствора ацетата натрия (рН 5,4) и два объема этанола. ДНК осаждали в течение ночи при -20°С. ДНК осаждали центрифугированием (13000 об/мин, 10 мин), последовательно промывали в 1 мл 70% этанола, 95% этанола и давали почти высохнуть. Затем ДНК растворяли в 100 мкл воды. Концентрацию и чистоту нуклеиновой кислоты измеряли при длине волны 260 нм, а отношение оптической плотности при 260 и 280 нм измеряли с использованием стерильной кварцевой кюветы в спектрофотометре.

Анализ ПЦР в реальном времени с использованием системы TaqMan (Yoshida et al., 2003) был использован в текущем исследовании для количественного анализа 16S рРНК F. nucleatum и P. gingivalis в покрытиях языка. Лизаты образцов готовили кипячением аликвоты в течение 10 минут после прокола крышки тонкой стерильной иглой для предотвращения повышения давления. ПЦР выполняли при общем объеме 20 мкл с использованием набора Light CyclerTM Fast Start DNA Master Hybridization Probes (Roche Diagnostics, Manheim, Germany), 500 нМ каждого из смысловых и антисмысловых праймеров, 200 нМ зонда и 5 мкл лизированных клеток. Используемые видоспецифичные праймеры и зонды TaqMan показаны в таблице 1. Специфичность амплифицированных продуктов и, следовательно, праймеров была подтверждена ранее (Kato et al., 2005; Yoshida et al., 2003). Амплификацию и детекцию проводили с помощью системы обнаружения последовательностей LightCycler (Roche Diagnostics, Манхейм, Германия) при следующих условиях цикла, идентичных для обоих анализов: 95°C в течение 10 минут, затем 45 циклов 95°C в течение 10 секунд, 58°C в течение 25 секунд и конечная элонгация. при 40С в течение 30сек. Стандартную кривую строили для каждого анализа с использованием серийных разведений известных количеств очищенной геномной ДНК каждого тестируемого организма.

Статистические методы:

Статистическая нулевая гипотеза об отсутствии связи между обнаружением неприятного запаха изо рта (наличие или отсутствие) и состоянием пародонта у некурящих субъектов была проверена с помощью логистической регрессии. Поскольку размер каждой клинической группы превышал 20, а минимальное количество пациентов с положительным неприятным запахом изо рта в клинической группе превышало десять, за исключением группы здоровых людей (девять пациентов с положительным неприятным запахом изо рта), размер выборки считался достаточным для применения этого статистического показателя. модель (Педуцци и др., 1996).

Связь между наличием или отсутствием неприятного запаха изо рта и клиническими показателями (PI, CPD, CAL, BOP, сайты > 5 мм CPD, WTCI) исследовали с помощью логистической регрессии. Коэффициент корреляции Спирмена ро оценивал связь между переменными шкалы, а также соответствие между оценками двух оценщиков запаха. Предположение о нормальности масштабных переменных проверялось тестом Шапиро-Уилка. Сравнения между группами проводились с использованием критерия Крускала-Уоллиса, а парные сравнения проводились с помощью критерия Манна-Уитни с поправкой Бонферрони на ошибку I рода.

Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения SPSS версии 16.0, уровень статистической значимости был установлен на уровне р<0,05.