Parámetros relacionados con el mal olor bucal y la enfermedad periodontal

Existe un debate en la literatura sobre si la periodontitis está relacionada con el mal olor oral y este estudio intenta comprender la forma en que la enfermedad periodontal se asocia con los parámetros relacionados con el mal olor oral.

Protocolo clínico:

Setenta y ocho no fumadores sistémicamente sanos fueron examinados para detectar halitosis oral en el Departamento de Periodoncia de la Universidad Aristóteles de Tesalónica, Grecia. Estos eran sujetos que no se quejaban de halitosis. Después de la evaluación inicial de idoneidad y la obtención de un consentimiento informado firmado aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Odontología de la Universidad Aristóteles de Tesalónica, se registró un registro periodontal de boca completa que incluía el índice de placa (PI), la profundidad de sondaje clínico (CPD) y la inserción clínica. (CAL) y sangrado al sondaje (BOP) en seis sitios por diente utilizando una sonda periodontal manual (Hu-Friedy XP-23/QW). Los sujetos que cumplían con los criterios clínicos de inclusión se clasificaron como periodontitis crónica (N=28), gingivitis crónica generalizada (N=23) o individuos sanos (27) y fueron monitorizados clínica y microbiológicamente.

Evaluación del revestimiento de la lengua:

El índice de recubrimiento de la lengua de Winkel (Winkel et al., 2003) se determinó visualmente dividiendo el dorso de la lengua en sextantes. A cada sextante se le asignó una puntuación entre cero y dos según el monto de los depósitos y estas puntuaciones se sumaron dando un total que va de cero a 12.

Recolección de muestra de lengua:

Se recolectó una muestra de la parte posterior del dorso de la lengua para el análisis cuantitativo de dos patógenos periodontales putativos, Porphyromonas gingivalis y Fusobacterium nucleatum, mediante PCR en tiempo real.

Para evitar la interferencia del sangrado al sondaje y la toma de muestras de la lengua con las evaluaciones organolépticas y principalmente con la evaluación del olor de la lengua, se volvió a llamar a los sujetos en una segunda visita a la misma hora del día y dentro de un período de cuatro días por mal olor oral. evaluación. Dentro de este corto intervalo de tiempo, se pidió a los participantes que no cambiaran sus hábitos dietéticos y de higiene oral de rutina, excepto 48 horas antes de la siguiente visita cuando se realizaron las evaluaciones de halitosis (Roldán et al., 2003; Donaldson et al., 2007). . Se dieron instrucciones escritas a cada participante sobre el consumo de alimentos y bebidas y hábitos de higiene bucal. En más detalle, se evitaron los alimentos picantes, la cebolla, el ajo, el alcohol y los enjuagues bucales 48 antes del examen. En la mañana de la evaluación se evitaron el café, las mentas, la goma de mascar, las prácticas de higiene bucal, los cosméticos perfumados o la loción para después del afeitado. Se permitió el consumo de agua y enjuagues bucales con agua al menos dos horas antes de la evaluación del olor. De manera similar, el juez que realizó las valoraciones organolépticas del mal olor bucal siguió las mismas instrucciones que los participantes durante 24 horas antes de realizar los exámenes.

Evaluación del mal olor bucal:

• Se utilizó el Halimeter® (Halimeter® RH-17, Interscan Corporation, Chatsworth, CA, EE. UU.) para medir la concentración de compuestos sulfurados volátiles (VSC) en partes por billón (p.p.b.) (Rosenberg et al., 1991). Las evaluaciones siempre se realizaron entre las 10.00 y las 12.00 horas en el mismo sillón dental de la clínica para minimizar la variabilidad diaria en la temperatura y la humedad de la habitación (Liu et al., 2006);
• Las evaluaciones organolépticas (ORG) que van de cero a cinco (Rosenberg et al., 1991) evaluaron el olor de los siguientes parámetros:

Aire de toda la boca (ORG1): se pidió a los sujetos que exhalaran suavemente en un tubo de 20 cm de largo a través de una pantalla, para evitar el contacto visual con el juez de olores, que evaluó el olor del aliento en el otro extremo del tubo (Murata et al., 2002) ; Región anterior del dorso de la lengua (ORG2): se les pidió a los sujetos que se lamieran las muñecas y esperaran un par de segundos para permitir que el área se secara antes de evaluar el olor; Región posterior de la lengua (ORG3): el material se recolectó de la parte posterior del dorso lingual de manera estandarizada con una cuchara de plástico; Aire nasal: se pidió a los sujetos que exhalaran por una fosa nasal después de tapar la fosa nasal opuesta con el dedo para excluir causas extraorales que pudieran estar relacionadas con el mal aliento.

Un solo "examinador" calibrado registró las mediciones periodontales y las lecturas de Halimeter®, mientras que un "juez" calibrado llevó a cabo las evaluaciones organolépticas de la halitosis. Todos los participantes fueron evaluados por el mismo examinador y juez. Para asegurar una recopilación de datos imparcial, el juez de olores estaba cegado con respecto a las mediciones de Halimeter® y el estado clínico del individuo. Antes y durante esta investigación, el juez de olores y un "evaluador" de olores adicional se estandarizaron repetidamente frente a una amplia gama de soluciones de n-butanol con intensidades de 25 a 6075 partes por millón (Nachnani et al., 2005; Saad et al., 2005) y también sobre el olor bucal de los pacientes que acuden a la clínica periodontal. Para evaluar la confiabilidad de las calificaciones del juez, el juez y el evaluador examinaron el olor de la boca de varios participantes del estudio sin estar al tanto de la puntuación del otro. Se encontró una correlación estadísticamente significativa entre las puntuaciones (rho de Spearman=0,64 para el olor del aire de toda la boca, p<0,001) (S.A.C.M.O.T., 2002). Cabe señalar que en el análisis de datos sólo se utilizaron las valoraciones del juez.

Los sujetos fueron designados como halitosis positivos (+) cuando el puntaje organoléptico del aire total de la boca era dos o más, y/o las lecturas del Halimeter® excedían 140 p.p.b.

Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real:

El ADN de la cepa W50 de P. gingivalis y la cepa ATCC 10953 de F. nucleatum se preparó en la Facultad de Odontología de la Universidad de Glasgow siguiendo el protocolo estándar. Brevemente, P. gingivalis y F. nucleatum se cultivaron en agar anaerobio exigente y se recolectaron después de tres a siete días. Los organismos de una sola placa de agar se recogieron con hisopos y se dispersaron en PBS que contenía EDTA disódico 0,1 mM (PBSE). Después de un lavado en PBS, se resuspendieron en 1 ml de agua desionizada estéril y se dividieron en alícuotas en dos microtapas con tapa roscada de 1,5 ml. El ADN se extrajo de los organismos colocando los tubos en un baño de agua hirviendo durante diez minutos. El lisado se mezcló con un volumen igual de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1; v/v/v) durante cinco minutos. Después de la centrifugación (13000 rpm, 10 min), la fase superior acuosa de cada preparación se transfirió a un tubo nuevo y se mezcló con un volumen de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) durante cinco minutos. Después de la centrifugación (13000 rpm, 10 min), la fase superior acuosa de cada preparación se transfirió a un tubo nuevo y se añadieron 0,1 volúmenes de solución de acetato de sodio 4,5 M (pH 5,4) y dos volúmenes de etanol. El ADN se precipitó durante la noche a -20oC. El ADN se sedimentó mediante centrifugación (13000 rpm, 10 min), se lavó secuencialmente en 1 ml de etanol al 70 %, etanol al 95 % y se dejó secar casi por completo. A continuación, el ADN se disolvió en 100 µl de agua. La concentración y pureza del ácido nucleico se midió a una longitud de onda de 260 nanómetros y la relación de absorbancia a 260 y 280 nanómetros se midió utilizando una cubeta de cuarzo estéril en un espectrofotómetro.

En el presente estudio se utilizó un ensayo de PCR en tiempo real con el sistema TaqMan (Yoshida et al., 2003) para el análisis cuantitativo del ARNr 16S de F. nucleatum y P. gingivalis en saburras linguales. Los lisados ​​de las muestras se prepararon hirviendo la alícuota durante 10 minutos después de perforar la tapa con una aguja estéril fina para evitar la acumulación de presión. La PCR se realizó en un volumen total de 20 μl utilizando el kit Light CyclerTM Fast Start DNA Master Hybridization Probes (Roche Diagnostics, Manheim, Alemania), 500 nM de cada uno de los cebadores sentido y antisentido, 200 nM de sonda y 5 μl de células lisadas. Los cebadores específicos de especie y las sondas TaqMan utilizadas se muestran en la Tabla 1. La especificidad de los productos amplificados y por tanto de los cebadores fue confirmada previamente (Kato et al., 2005; Yoshida et al., 2003). La amplificación y detección se realizaron con el LightCycler Sequence Detection System (Roche Diagnostics, Manheim, Alemania) con las siguientes condiciones de ciclo, idénticas para ambos ensayos: 95C por 10min, y luego 45 ciclos de 95C por 10seg, 58C por 25seg y una elongación final a 40C durante 30 seg. Se trazó una curva estándar para cada ensayo utilizando diluciones en serie de cantidades conocidas de ADN genómico purificado de cada organismo de prueba.

Métodos de estadística:

La hipótesis estadística nula de que no existe asociación entre la detección de halitosis (presencia o ausencia) y el estado periodontal en sujetos no fumadores se probó mediante regresión logística. Dado que el tamaño de cada grupo clínico era superior a 20 y el número mínimo de sujetos halitosis positivos por grupo clínico superaba los diez, con excepción del grupo sano (nueve sujetos halitosis positivos), el tamaño de la muestra se consideró adecuado para la aplicación de esta estadística. modelo (Peduzzi et al. 1996).

La asociación entre la presencia o ausencia de halitosis y los índices clínicos (PI, CPD, CAL, BOP, sitios > 5 mm CPD, WTCI) se examinó mediante regresión logística. El coeficiente de correlación rho de Spearman estimó la asociación entre las variables de escala y también la concordancia entre las puntuaciones de los dos evaluadores de olor. El supuesto de normalidad para las variables de escala se probó mediante la prueba de Shapiro Wilk. Las comparaciones entre grupos se realizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis, mientras que las comparaciones por pares se realizaron mediante la prueba de Mann-Whitney con el ajuste de error tipo I de Bonferroni.

El análisis de los datos se realizó con el software SPSS versión 16.0 y el nivel de significación estadística se fijó en p<0,05.