Oral illeluktende og periodontale sykdomsrelaterte parametere

Det eksisterer en debatt i litteraturen om hvorvidt periodontitt er knyttet til oral illelukt, og denne studien forsøker å forstå måten periodontal sykdom er assosiert med oral illelukt-relaterte parametere.

Klinisk protokoll:

Syttiåtte systemisk friske ikke-røykere ble screenet for oral halitose ved avdelingen for periodontologi, Aristoteles-universitetet i Thessaloniki, Hellas. Dette var ikke-halitose-klagende personer. Etter innledende screening for egnethet og innhenting av et signert informert samtykke godkjent av Dental School, Aristoteles University of Thessaloniki, ble det registrert en full-munn periodontal kartlegging inkludert plakkindeks (PI), klinisk sonderingsdybde (CPD), klinisk tilknytning nivåer (CAL) og blødning ved sondering (BOP) på seks steder per tann ved bruk av en manuell periodontal sonde (Hu-Friedy XP-23/QW). Personene som oppfylte de kliniske inklusjonskriteriene ble klassifisert som kronisk periodontitt (N=28), kronisk generalisert gingivitt (N=23) eller friske individer (27) og ble videre klinisk og mikrobiologisk overvåket.

Vurdering av tungebelegg:

Winkel Tongue Coating Index (Winkel et al., 2003) ble visuelt bestemt ved å dele opp tungens rygg i sekstanter. En poengsum mellom null og to ble gitt til hver sekstant i henhold til mengden avsetninger, og disse poengsummene ble lagt til, noe som ga en total fra null til 12.

Samling av tungeprøve:

En prøve ble tatt fra baksiden av tungeryggen for kvantitativ analyse av to antatte periodontale patogener, Porphyromonas gingivalis og Fusobacterium nucleatum, ved sanntids-PCR.

For å unngå forstyrrelser av blødning ved sondering og tungeprøvetaking med de organoleptiske vurderingene og først og fremst med evalueringen av tungelukten, ble forsøkspersonene tilbakekalt på et nytt besøk på samme tid på dagen og innen en periode på fire dager for oral illelukt evaluering. Innenfor dette korte tidsintervallet ble deltakerne bedt om ikke å endre sine rutinemessige kostholds- og munnhygienevaner med unntak av 48 timer før neste besøk da halitosevurderingene ble utført (Roldán et al., 2003; Donaldson et al., 2007) . Skriftlige instruksjoner ble gitt til hver deltaker angående mat- og drikkeforbruk og munnhygienevaner. Mer detaljert ble krydret mat, løk, hvitløk, alkohol og munnvann unngått 48 før undersøkelsen. På evalueringsmorgen ble kaffe, mynte, tyggegummi, munnhygienepraksis, duftende kosmetikk eller aftershave lotion unngått. Inntak av vann og munnskylling med vann ble tillatt minst to timer før luktvurderingen. På lignende måte fulgte dommeren som utførte de organoleptiske vurderingene av oral illelukt de samme instruksjonene som deltakerne i 24 timer før de foretok undersøkelsene.

Oral illeluktvurdering:

• Halimeter® (Halimeter® RH-17, Interscan Corporation, Chatsworth, CA, USA) ble brukt til å måle konsentrasjonen av flyktige sulfidforbindelser (VSC) i deler per milliard (p.p.b.) (Rosenberg et al., 1991). Vurderingene ble alltid utført mellom 10.00-12.00 ved samme tannlegestol i klinikken for å minimere daglig variasjon i rommets temperatur og fuktighet (Liu et al., 2006);
• Organoleptiske vurderinger (ORG) fra null til fem (Rosenberg et al., 1991) vurderte lukten til følgende parametere:

Hel munnluft (ORG1) - forsøkspersoner ble bedt om å puste forsiktig ut i et 20 cm langt rør gjennom en skjerm, for å unngå øyekontakt med luktdommeren, som evaluerte pustelukt i den andre enden av røret (Murata et al., 2002) ; Fremre region av tungeryggen (ORG2) - forsøkspersonene ble bedt om å slikke håndleddene og vente et par sekunder for å la området tørke ut før lukten ble vurdert; Bakre tungeregion (ORG3) - materiale ble høstet fra baksiden av lingualryggen på en standardisert måte ved bruk av en plastskje; Neseluft - forsøkspersoner ble bedt om å puste ut gjennom det ene neseboret etter å ha lukket det motsatte neseboret med fingeren for å utelukke ekstraorale årsaker som kan være relatert til dårlig ånde.

En kalibrert enkelt "undersøker" registrerte periodontale målinger og Halimeter®-avlesninger, mens en kalibrert "dommer" utførte de organoleptiske vurderingene av halitose. Alle deltakerne ble vurdert av samme sensor og dommer. For å sikre objektiv datainnsamling ble luktdommeren blindet angående Halimeter®-målingene og den kliniske statusen til individet. Før og under denne undersøkelsen ble luktdommeren og en ekstra lukt-"evaluator" gjentatte ganger standardisert mot et bredt spekter av n-butanolløsninger med intensiteter fra 25 til 6075 deler per million (Nachnani et al., 2005; Saad et al., 2005) og også på munnlukten til pasienter som går på periodontalklinikken. For å vurdere påliteligheten til dommerens vurderinger, undersøkte dommeren og evaluatoren munnlukten til en rekke studiedeltakere uten å være klar over hverandres poengsum. Det ble funnet en statistisk signifikant korrelasjon mellom skårene (Spearmans rho=0,64 for lukt av helmunnluft, p<0,001) (S.A.C.M.O.T., 2002). Det skal bemerkes at kun dommerens vurderinger ble brukt i dataanalyse.

Personer ble utpekt som halitose positive (+) når enten den organoleptiske poengsummen for hele munnluften var to eller mer, og/eller avlesningene til Halimeter® oversteg 140 p.p.b.

Sanntids polymerasekjedereaksjon:

DNA fra P. gingivalis-stamme W50 og F. nucleatum-stamme ATCC 10953 ble fremstilt ved Dental School, University of Glasgow i henhold til standardprotokollen. Kort fortalt ble P. gingivalis og F. nucleatum dyrket på kresen anaerob agar og høstet etter tre til syv dager. Organismene fra en enkelt agarplate ble høstet med vattpinner og dispergert i PBS inneholdende 0,1 mM dinatrium EDTA (PBSE). Etter én vask i PBS, ble de resuspendert i 1 ml sterilt avionisert vann og delt opp i to 1,5 ml skrulokk-mikrokorker. DNA ble ekstrahert fra organismene ved å plassere rørene i et kokende vannbad i ti minutter. Lysatet ble blandet med et likt volum fenol: kloroform: isoamylalkohol (25:24:1; v/v/v) i fem minutter. Etter sentrifugering (13000 rpm, 10 min) ble den vandige øvre fase fra hvert preparat overført til et friskt rør og blandet med ett volum kloroform: isoamylalkohol (24:1) i fem minutter. Etter sentrifugering (13000 rpm, 10 minutter) ble den vandige øvre fase fra hvert preparat overført til et friskt rør og 0,1 volum 4,5 M natriumacetatløsning (pH 5,4) og to volumer etanol ble tilsatt. DNA ble presipitert over natten ved -20oC. DNA ble pelletert ved sentrifugering (13000 rpm, 10 min) vasket sekvensielt i 1 ml 70% etanol, 95% etanol og fikk nesten tørke. DNA ble deretter oppløst i 100 ul vann. Nukleinsyrekonsentrasjonen og renheten ble målt ved en bølgelengde på 260 nanometer og forholdet mellom absorbansen ved 260 og 280 nanometer ble målt ved bruk av en steril kvartskyvette i et spektrofotometer.

En sanntids PCR-analyse ved bruk av TaqMan-systemet (Yoshida et al., 2003) ble brukt i den nåværende studien for kvantitativ analyse av 16S rRNA fra F. nucleatum og P. gingivalis i tungebelegg. Lysater av prøver ble fremstilt ved å koke alikvoten i 10 minutter etter å ha punktert hetten med en fin steril nål for å forhindre trykkoppbygging. PCR ble utført ved et totalt volum på 20 μl ved bruk av Light CyclerTM Fast Start DNA Master Hybridization Probes-settet (Roche Diagnostics, Manheim, Tyskland), 500 nM hver av sense- og antisense-primere, 200 nM probe og 5 μl lyserte celler. De artsspesifikke primerne og TaqMan-probene som brukes er vist i tabell 1. Spesifisiteten til de amplifiserte produktene og derfor til primerne ble bekreftet tidligere (Kato et al., 2005; Yoshida et al., 2003). Amplifikasjon og deteksjon ble utført med LightCycler Sequence Detection System (Roche Diagnostics, Manheim, Tyskland) med følgende syklusbetingelser, identiske for begge analysene: 95C i 10 minutter, og deretter 45 sykluser med 95C i 10 sekunder, 58C i 25 sekunder og en siste forlengelse ved 40C i 30 sek. En standardkurve ble plottet for hver analyse ved å bruke seriefortynninger av kjente mengder renset genomisk DNA fra hver testorganisme.

Statistiske metoder:

Den statistiske nullhypotesen om at det ikke er noen sammenheng mellom påvisning av halitose (tilstedeværelse eller fravær) og periodontal status hos ikke-røykere ble testet ved logistisk regresjon. Siden størrelsen på hver klinisk gruppe var over 20 og minimumsantallet av halitosepositive forsøkspersoner per klinisk gruppe oversteg ti, med unntak av den friske gruppen (ni halitosepositive forsøkspersoner), ble prøvestørrelsen ansett som tilstrekkelig for bruken av denne statistikken modell (Peduzzi et al. 1996).

Sammenhengen mellom halitose tilstedeværelse eller fravær og kliniske indekser (PI, CPD, CAL, BOP, steder > 5 mm CPD, WTCI) ble undersøkt ved bruk av logistisk regresjon. Spearmans rho-korrelasjonskoeffisient estimerte sammenhengen mellom skalavariabler og også samsvaret mellom skårene til de to luktbedømmerne. Antakelsen om normalitet for skalavariabler ble testet ved Shapiro Wilk-testen. Sammenligninger mellom grupper ble utført ved bruk av Kruskal-Wallis-testen, mens parvise sammenligninger ble utført ved Mann-Whitney-testen med Bonferronis justering av type I-feil.

Analysen av data ble utført ved bruk av SPSS versjon 16.0-programvaren og nivået av statistisk signifikans ble satt til p<0,05.