幹細胞感受性アッセイのフィージビリティスタディ (STELLA)

患者 ＬＣ、ＣＲＣおよびＢＣを有し、全身状態が良好で、腫瘍組織が利用可能であり、従来の治療法が失敗したか、または有効性が証明された治療法で治療される可能性がない患者が研究に含まれる。 最初の患者の特徴付けには、次の項目に関する詳細な情報が含まれます：性別、年齢、病歴、併存疾患、身体検査、血球数、肝臓および腎機能の完全な血液分析、凝固、血清学的腫瘍マーカー、腫瘍の位置と病期、腫瘍塊、転移。

ＬＣ、ＣＲＣおよびＢＣ ＣＳＣの同定 ＬＣ、ＣＲＣおよびＢＣを有する患者から得られた腫瘍組織のサンプルから開始して、ＣＳＣの単離および特徴付けを行う。 腫瘍組織は、研究に参加する前に収集されます。つまり、プロトコル以外の目的で手術や生検などの診断または治療手順中に得られた組織です。収集された手術サンプルは、腫瘍の特定の組織学的特徴に従って分類されます。 各サンプルから、酵素的および機械的手順により、CSCが取得され、その後、生化学的および分子的研究に使用される適切な培地で培養されます。 各サンプルは、手術時の患者の病歴と、CSCの生物学的特性に予後値を割り当てるための定期的な臨床および機器制御からなる適切なフォローアッププログラムに関連付けられます。 選択された上皮腫瘍に由来する幹細胞は、細胞の表現型の決定的な特性を提供するために、表面および細胞内マーカーの分析を受けます。 肺がん、CRC、および BC に由来する幹細胞は、マーカー CD133 陽性の腫瘍細胞のサブセットとして識別されます。

腫瘍標本を数回洗浄し、汚染を避けるために高用量のペニシリン/ストレプトマイシンおよびファンギゾンを補充したDMEM:F12培地に一晩放置する。 組織解離は、酵素消化によって行われ、回収された細胞は、25 μg/ml インスリン、100 μg/ml アポトランスフェリン、10 μg/ml プトレシン、0.03 mM 亜セレン酸ナトリウム、20nM プロゲステロン、0.6% グルコースを含む無血清培地で培養されます。 、5 mM hepes、0.1% 炭酸水素ナトリウム、0.4% BSA、グルタミンおよび抗生物質を DMEM-F12 培地に溶解し、20 ng/ml EGF および 10 ng/ml bFGF を添加。 組織培養用に未処理のフラスコを使用して、細胞接着および未分化腫瘍球の好みの増殖を減少させる。 これらの培養条件は、未熟な腫瘍細胞を選択しますが、非悪性細胞または分化細胞は、異なる起源の CSC について評価されるようにネガティブに選択されます。 生き残った未熟な腫瘍細胞はゆっくりと増殖し、これらの培養条件で 1 ～ 2 か月以内に腫瘍細胞の凝集体である「球体」を生じます。 スフィア形成細胞は、スフィアを機械的に解離させた後、完全に新鮮な培地に単一細胞と残りの小細胞凝集体を再プレーティングすることで増殖させることができます。

LC、CRC、および BC 球体形成細胞の分化は、特定の培地 (Cambrex) での細胞培養によって得られます。 LC、CRC、および BC スフィアの表現型とそれらの分化した子孫は、フローサイトメトリー分析または免疫蛍光法によって分析されます。 特に、CD133、CD34、BCRP1 などの幹細胞マーカーが分析されます。

続いて、増殖、自己再生、および生存のプロセスに関与する経路の状態を定義するために、がん領域が分析されます。 特に、幹細胞のホメオスタシスに関与する経路の活性と変化の可能性を調査するために、腫瘍特異的分析が行われます。主要な細胞経路の活性化状態の全体像。

前臨床モデル がん球体を使用することにより、研究者は、攻撃的な特徴と侵襲性の可能性を含む、親腫瘍の挙動を再現する同所性異種移植片モデルを作成します。 同所性同種注射技術は、5週齢のNOD / SCIDマウスで評価されます。 注入手順は、解剖顕微鏡のサポートで行われます。 麻酔後、ルシフェラーゼなどの生物発光タンパク質を発現するように改変された 200 ～ 500 個の癌球細胞を、ハミルトン注射器と 32 ゲージ針を使用して注射します。 転移性腫瘍と局所腫瘍は、成長率などの表現型分析、または軟寒天でのクローン形成能力を含む他の幹細胞特性、または限界希釈アッセイを通じて、幹細胞含有量について比較されます。 緑色蛍光 (GFP) およびルシフェラーゼ レポーター タンパク質をコードするレンチウイルス ベクターによる CSC の感染により、CSC が in vivo で追跡できるようになります。 特に、両栄養性パッケージング細胞株２９３Ｔは、リン酸カルシウム／クロロキン法によってトランスフェクトされる。 ウイルス粒子を含む培養上清は、トランスフェクションの48時間後に収集されます。 感染は、CO2 インキュベーターで 3 時間、0.45 microm フィルター処理されたウイルス上清で標的細胞を培養することによって実行されます。 細胞を感染させるために、2回の感染サイクルが行われます。 ウイルスパッケージングおよび標的細胞におけるGFP発現の顕微鏡評価は、FITCフィルターを備えた逆蛍光顕微鏡を使用して細胞を直接観察することによって行われます。 感染後、ルシフェラーゼで形質導入された細胞は、フローサイトメトリーによって選別され、純粋なマークされた集団が得られます。 局所腫瘍と侵襲性の発達は、全身イメージング技術によって監視されます。これにより、マークされた細胞集団の非侵襲的な局在化で、光信号（生物発光）を動的に検出、局在化、定量化できます。 この手順は、フォトン イメージャー in vivo イメージング システム (Biospace Lab) を使用して実行され、取得および画像解析用の最新のソフトウェアによって支援されます。 このシステムのおかげで、最近実験室で取得され、非常に高い感度と 20 ミリ秒の時間分解能が特徴で、調査員は麻酔をかけられていない自由に動く動物を分析します。 生物発光信号は、動物の標準ビデオとして同時に取得されます。 研究者が腫瘍増殖の成功を確信したら、マウスを屠殺します。 腫瘍は、形態学的特徴付けおよびリン酸化プロテオーム分析のために除去されます。 この後者は、高度な感度、精度、および直線性の達成を可能にする逆相タンパク質マイクロアレイを介して実行され、未熟および分化した肺癌細胞のシグナルタンパク質のリン酸化状態を定量化することを可能にします。 このシステムは、LC、CRC、および BC 細胞の増殖と拡散に関与する特定の分子経路に関する情報を提供します。

抗腫瘍剤に対する腫瘍の感受性 推定される腫瘍および浸潤開始細胞に対して有効な治療用化合物を選択的に識別するために、研究者は、特異な時間に特異的に組み合わされたいくつかの抗腫瘍薬に曝露した後、クローン原性 LC、CRC、および BC の生存率を測定します。ポイント最大96時間。