Estudio de viabilidad sobre el ensayo de sensibilidad de células madre (STELLA)

Pacientes Se incluirán en el estudio pacientes con CP, CCR y CM en buen estado funcional y con tejido tumoral disponible, en caso de fracaso de las terapias convencionales o sin posibilidad de ser tratados con terapia de eficacia comprobada. La caracterización inicial del paciente incluirá información detallada sobre los siguientes elementos: sexo, edad, historial clínico, comorbilidad, examen físico, recuento de células sanguíneas, análisis de sangre completos para función hepática y renal, coagulación, marcadores tumorales serológicos, ubicación y estadio del tumor, masa tumoral, metástasis.

Identificación de CSC en LC, CRC y BC El aislamiento y caracterización de las CSC se realizará a partir de muestras de tejido tumoral obtenidas de pacientes con LC, CCR y BC. El tejido tumoral se recolectará antes del ingreso al estudio, es decir, el tejido obtenido durante un procedimiento diagnóstico o terapéutico, como cirugía o biopsias con fines distintos al protocolo. Las muestras quirúrgicas recolectadas se clasificarán de acuerdo con las características histológicas específicas del tumor. De cada muestra, mediante procedimientos enzimáticos y mecánicos, se obtendrán las CSC, que luego se cultivarán en medios de cultivo adecuados para su posterior uso en estudios bioquímicos y moleculares. A cada muestra se le asociará la historia del paciente en el momento quirúrgico y un adecuado programa de seguimiento consistente en controles clínicos e instrumentales periódicos que con el fin de asignar un valor pronóstico a las características biológicas de las CSC. Las células madre derivadas de los tumores epiteliales seleccionados se someterán luego a análisis de marcadores intracelulares y de superficie para proporcionar una caracterización definitiva del fenotipo celular. Las células madre derivadas de cáncer de pulmón, CRC y BC se identifican como un subconjunto de células tumorales positivas para el marcador CD133.

Las muestras de tumores se lavarán varias veces y se dejarán durante la noche en medio DMEM:F12 complementado con altas dosis de penicilina/estreptomicina y fungizona para evitar la contaminación. La disociación del tejido se llevará a cabo mediante digestión enzimática y las células recuperadas se cultivarán en un medio sin suero que contiene 25 microg/ml de insulina, 100 microg/ml de apotransferrina, 10 microg/ml de putrescina, selenito de sodio 0,03 mM, progesterona 20 nM, glucosa al 0,6 %. , hepes 5 mM, bicarbonato de sodio al 0,1 %, BSA al 0,4 %, glutamina y antibióticos, disueltos en medio DMEM-F12 y suplementados con 20 ng/ml de EGF y 10 ng/ml de bFGF. Se utilizarán matraces no tratados para cultivo de tejidos con el fin de reducir la adherencia celular y favorecer el crecimiento de esferas tumorales indiferenciadas. Estas condiciones de cultivo seleccionan células tumorales inmaduras, mientras que las células no malignas o diferenciadas se seleccionan negativamente según lo evaluado para CSC de diferente origen. Las células tumorales inmaduras supervivientes proliferan lentamente dando lugar a agregados de células tumorales, "esferas", en 1-2 meses en estas condiciones de cultivo. Las células formadoras de esferas se pueden expandir mediante la disociación mecánica de las esferas, seguida de una nueva placa de células individuales y agregados de células pequeñas residuales en medio fresco completo.

La diferenciación de las células formadoras de esferas LC, CRC y BC se obtendrá mediante cultivo celular en medio específico (Cambrex). El fenotipo de las esferas LC, CRC y BC y su progenie diferenciada se analizará mediante análisis de citometría de flujo o inmunofluorescencia. En particular, se analizarán marcadores de células madre como CD133, CD34 y BCRP1.

Sucesivamente, se analizarán las esferas del cáncer para definir el estado de las vías involucradas en el proceso de proliferación, autorrenovación y supervivencia. En particular, se llevarán a cabo análisis específicos de tumores para investigar la actividad y la posible alteración de las vías responsables de la homeostasis de las células madre y análisis globales (fosfoproteómicos y análisis de transducción de señales, pruebas de fármacos innovadores, análisis de procesos de metástasis in vivo) destinados a proporcionar una imagen general del estado de activación de las vías celulares clave.

Modelo preclínico Mediante el uso de esferas de cáncer, los investigadores generarán modelos de xenoinjertos ortotópicos que recapitulan el comportamiento del tumor original, incluidas las características agresivas y el potencial de invasividad. La técnica de inyección ortotópica se evaluará en ratones NOD/SCID de 5 semanas de edad. El procedimiento de inyección se realizará con el apoyo de un microscopio de disección. Después de la anestesia, se inyectarán de 200 a 500 células esféricas de cáncer, modificadas para expresar una proteína bioluminiscente como la luciferasa, utilizando una jeringa Hamilton y una aguja de calibre 32. Los tumores metastásicos y locales se compararán en cuanto a su contenido de células madre mediante análisis fenotípicos, como la tasa de crecimiento u otras propiedades de las células madre, incluida la capacidad clonogénica en agar blando o mediante ensayos de dilución limitante. La infección de CSC con vector lentiviral, que codifica para fluorescente verde (GFP), así como proteínas indicadoras de luciferasa, permitirá el seguimiento de CSC in vivo. En particular, la línea celular de empaquetamiento anfotrópico 293T se transfectará mediante el método de fosfato de calcio/cloroquina. Los sobrenadantes de cultivo que contienen partículas virales se recolectarán después de 48 h de transfección. La infección se realizará mediante el cultivo de células diana en sobrenadante viral filtrado de 0,45 microm durante 3 h en una incubadora de CO2. Se realizarán dos ciclos de infección para infectar las células. La evaluación microscópica de la expresión de GFP en el empaquetamiento viral y las células diana se realizará mediante la observación directa de las células mediante un microscopio de fluorescencia inversa equipado con un filtro FITC. Después de la infección, las células transducidas con luciferasa se clasificarán mediante citometría de flujo para obtener una población marcada pura. El tumor local y el desarrollo de la invasividad serán monitoreados a través de técnicas de imagen de cuerpo completo, que permitirán detectar, localizar y cuantificar dinámicamente la señal óptica -bioluminiscencia- en una localización no invasiva de la población celular marcada. Este procedimiento se realizará utilizando el sistema de imágenes in vivo Photon imager (Biospace Lab), asistido por el software más reciente para la adquisición y el análisis de imágenes. Gracias a este sistema, recientemente adquirido en el laboratorio y caracterizado por una sensibilidad muy alta y una resolución temporal de 20 ms, los investigadores analizarán animales no anestesiados y en movimiento libre. La señal de bioluminiscencia se adquirirá simultáneamente como un video estándar del animal. Una vez que los investigadores estén seguros del éxito del crecimiento del tumor, se sacrificarán los ratones. Se extirpará el tumor para su caracterización morfológica y análisis fosfoproteómico. Esta última se realizará a través de microarrays de proteínas de fase inversa, que permiten alcanzar un alto grado de sensibilidad, precisión y linealidad, posibilitando cuantificar el estado fosforilado de las proteínas señal en células inmaduras y diferenciadas de cáncer de pulmón. Este sistema proporcionará información sobre vías moleculares específicas implicadas en el crecimiento y la propagación de células LC, CRC y BC.

Sensibilidad del tumor a los agentes antitumorales Para discriminar selectivamente los compuestos terapéuticos efectivos contra el tumor putativo y las células iniciadoras de la invasión, los investigadores medirán la viabilidad de LC, CRC y BC clonogénicos después de la exposición a varios fármacos antitumorales combinados diferencialmente en un momento único. punto hasta 96 horas.