Studio di fattibilità sul saggio di sensibilità delle cellule staminali (STELLA)

Pazienti Saranno inclusi nello studio pazienti con LC, CRC e BC con buon performance status e con tessuto tumorale disponibile, al fallimento delle terapie convenzionali o senza possibilità di essere trattati con terapia di comprovata efficacia. La caratterizzazione iniziale del paziente includerà informazioni dettagliate sui seguenti elementi: sesso, età, storia clinica, comorbilità, esame fisico, conta delle cellule del sangue, analisi del sangue complete per funzionalità epatica e renale, coagulazione, marcatori tumorali sierologici, posizione e stadio del tumore, massa tumorale, metastasi.

LC, CRC e BC Identificazione delle CSC L'isolamento e la caratterizzazione delle CSC sarà effettuato a partire da campioni di tessuto tumorale ottenuti da pazienti con LC, CRC e BC. Il tessuto tumorale verrà raccolto prima dell'ingresso nello studio, ovvero il tessuto ottenuto durante una procedura diagnostica o terapeutica, come interventi chirurgici o biopsie con scopi diversi dal protocollo. I campioni chirurgici raccolti saranno classificati in base alle specifiche caratteristiche istologiche del tumore. Da ciascun campione, mediante procedure enzimatiche e meccaniche, verranno ottenute le CSC che verranno poi coltivate in adeguati terreni di coltura per essere successivamente utilizzate per studi biochimici e molecolari. Ad ogni campione sarà associata l'anamnesi del paziente al momento dell'intervento e un opportuno programma di follow-up costituito da controlli clinici e strumentali periodici al fine di assegnare un valore prognostico alle caratteristiche biologiche delle CSC. Le cellule staminali derivate dai tumori epiteliali selezionati saranno poi sottoposte ad analisi di marcatori di superficie ed intracellulari al fine di fornire una caratterizzazione definitiva del fenotipo cellulare. Le cellule staminali derivate da carcinoma polmonare, CRC e BC sono identificate come un sottoinsieme di cellule tumorali positive per il marcatore CD133.

I campioni tumorali saranno lavati più volte e lasciati per una notte in terreno DMEM:F12 integrato con alte dosi di Penicillina/Streptomicina e Fungizone per evitare la contaminazione. La dissociazione dei tessuti sarà effettuata mediante digestione enzimatica e cellule recuperate coltivate in terreno privo di siero contenente 25 microg/ml di insulina, 100 microg/ml di apo-transferrina, 10 microg/ml di putrescina, 0.03 mM di selenito di sodio, 20nM di progesterone, 0.6% di glucosio , 5 mM di hepes, 0,1% di bicarbonato di sodio, 0,4% di BSA, glutammina e antibiotici, sciolti in terreno DMEM-F12 e integrati con 20 ng/ml di EGF e 10 ng/ml di bFGF. Saranno utilizzate fiasche non trattate per la coltura tissutale al fine di ridurre l'aderenza cellulare e favorire la crescita di sfere tumorali indifferenziate. Queste condizioni di coltura selezionano le cellule tumorali immature, mentre le cellule non maligne o differenziate vengono selezionate negativamente come valutate per le CSC di diversa origine. Le cellule tumorali immature sopravvissute proliferano lentamente dando origine ad aggregati di cellule tumorali, "sfere", entro 1-2 mesi in queste condizioni di coltura. Le cellule che formano sfere possono essere espanse mediante dissociazione meccanica delle sfere, seguita dalla sostituzione delle singole cellule e degli aggregati di piccole cellule residue in mezzo fresco completo.

La differenziazione delle cellule sferiche LC, CRC e BC sarà ottenuta mediante coltura cellulare in terreno specifico (Cambrex). Il fenotipo delle sfere LC, CRC e BC e la loro progenie differenziata saranno analizzati mediante analisi citometrica a flusso o immunofluorescenza. In particolare verranno analizzati marcatori di cellule staminali quali CD133, CD34 e BCRP1.

Successivamente, verranno analizzate le sfere tumorali per definire lo stato delle vie coinvolte nel processo di proliferazione, autorinnovamento e sopravvivenza. In particolare, verranno effettuate analisi tumore-specifiche per indagare l'attività e l'eventuale alterazione delle vie responsabili dell'omeostasi delle cellule staminali e analisi globali (analisi fosfoproteomica e di trasduzione del segnale, test farmacologici innovativi, analisi dei processi di metastatizzazione in vivo) volte a fornire un quadro generale dello stato di attivazione delle principali vie cellulari.

Modello preclinico Utilizzando sfere tumorali, i ricercatori genereranno modelli di xenotrapianti ortotopici che ricapitolano il comportamento del tumore dei genitori, comprese le caratteristiche aggressive e il potenziale di invasività. La tecnica di iniezione ortotopica sarà valutata in topi NOD/SCID di 5 settimane. La procedura di iniezione verrà eseguita con il supporto di un microscopio da dissezione. Dopo l'anestesia, verranno iniettate da 200 a 500 cellule tumorali sferiche, modificate per esprimere una proteina bioluminescente come la luciferasi, utilizzando una siringa Hamilton e un ago calibro 32. I tumori metastatici e locali saranno confrontati per il loro contenuto di cellule staminali attraverso l'analisi fenotipica come il tasso di crescita o altre proprietà delle cellule staminali inclusa la capacità clonogenica in agar morbido o attraverso saggi di diluizione limitante. L'infezione delle CSC con il vettore lentivirale, che codifica per la fluorescenza verde (GFP), così come le proteine ​​reporter della luciferasi, consentirà il tracciamento delle CSC in vivo. In particolare, la linea cellulare anfotropica 293T sarà trasfettata mediante il metodo calcio-fosfato/clorochina. I surnatanti di coltura contenenti particelle virali saranno raccolti dopo 48 ore dalla trasfezione. L'infezione sarà eseguita coltivando cellule bersaglio in supernatante virale filtrato da 0.45 microm per 3 ore in un incubatore a CO2. Verranno eseguiti due cicli di infezione per infettare le cellule. La valutazione microscopica dell'espressione di GFP nel packaging virale e nelle cellule bersaglio sarà eseguita mediante osservazione diretta delle cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza inversa dotato di un filtro FITC. Dopo l'infezione, le cellule trasdotte con luciferasi saranno selezionate mediante citometria a flusso per ottenere una popolazione marcata pura. Il tumore locale e lo sviluppo dell'invasività saranno monitorati attraverso tecniche di imaging di tutto il corpo, che permetteranno di rilevare, localizzare e quantificare dinamicamente il segnale ottico - bioluminescenza - in una localizzazione non invasiva della popolazione cellulare marcata. Questa procedura verrà eseguita utilizzando il sistema di imaging in vivo Photon imager (Biospace Lab), assistito dai più recenti software per l'acquisizione e l'analisi delle immagini. Grazie a questo sistema, recentemente acquisito in laboratorio e caratterizzato da una sensibilità molto elevata e una risoluzione temporale di 20 ms, i ricercatori analizzeranno animali non anestetizzati e in movimento libero. Il segnale di bioluminescenza verrà acquisito simultaneamente come un video standard dell'animale. Una volta che gli investigatori saranno sicuri del successo della crescita del tumore, i topi verranno sacrificati. Il tumore sarà rimosso per la caratterizzazione morfologica e l'analisi fosfoproteomica. Quest'ultimo verrà eseguito mediante microarray di proteine ​​in fase inversa, che consente di ottenere un elevato grado di sensibilità, precisione e linearità, rendendo possibile la quantificazione dello stato fosforilato delle proteine ​​segnale in cellule tumorali polmonari immature e differenziate. Questo sistema fornirà informazioni su specifici percorsi molecolari coinvolti nella crescita e diffusione delle cellule LC, CRC e BC.

Sensibilità del tumore agli agenti antitumorali Per discriminare selettivamente i composti terapeutici efficaci contro il tumore putativo e le cellule che iniziano l'invasione, i ricercatori misureranno la vitalità di LC clonogenico, CRC e BC dopo l'esposizione a diversi farmaci antitumorali combinati in modo differenziale in un momento singolare punto fino a 96 ore.