Estudo de Viabilidade do Ensaio de Sensibilidade de Células-Tronco (STELLA)

Pacientes Serão incluídos no estudo pacientes com CL, CCR e CM com bom desempenho e com tecido tumoral disponível, em falha das terapias convencionais ou sem possibilidade de serem tratados com terapia de eficácia comprovada. A caracterização inicial do paciente incluirá informações detalhadas sobre os seguintes itens: sexo, idade, história clínica, comorbidade, exame físico, hemograma, análises sanguíneas completas para função hepática e renal, coagulação, marcadores tumorais sorológicos, localização e estágio do tumor, massa tumoral, metástases.

Identificação de LC, CRC e BC CSCs O isolamento e caracterização de CSCs serão feitos a partir de amostras de tecido tumoral obtidas de pacientes com LC, CRC e BC. O tecido tumoral será coletado antes da entrada no estudo, ou seja, tecido obtido durante um procedimento diagnóstico ou terapêutico, como cirurgia ou biópsias com outros fins que não o protocolo. As amostras cirúrgicas coletadas serão classificadas de acordo com as características histológicas específicas do tumor. De cada amostra, por meio de procedimentos enzimáticos e mecânicos, serão obtidas as CSCs que serão cultivadas em meios de cultura adequados para posterior utilização em estudos bioquímicos e moleculares. Cada amostra será associada ao histórico do paciente no momento da cirurgia e a um programa de acompanhamento adequado, composto por controles clínicos e instrumentais periódicos, a fim de atribuir um valor prognóstico às características biológicas das CSCs. As células-tronco derivadas dos tumores epiteliais selecionados serão então submetidas à análise de marcadores de superfície e intracelulares, a fim de fornecer uma caracterização definitiva do fenótipo celular. Células-tronco derivadas de câncer de pulmão, CRC e BC são identificadas como um subconjunto de células tumorais positivas para o marcador CD133.

Amostras tumorais serão lavadas várias vezes e deixadas durante a noite em meio DMEM:F12 suplementado com altas doses de Penicilina/Estreptomicina e Fungizone para evitar contaminação. A dissociação tecidual será realizada por digestão enzimática e as células recuperadas cultivadas em meio isento de soro contendo 25 µg/ml de insulina, 100 µg/ml de apotransferrina, 10 µg/ml de putrescina, 0,03 mM de selenito de sódio, 20 nM de progesterona, 0,6% de glicose , 5 mM de hepes, 0,1% de bicarbonato de sódio, 0,4% de BSA, glutamina e antibióticos, dissolvidos em meio DMEM-F12 e suplementado com 20 ng/ml de EGF e 10 ng/ml de bFGF. Frascos não tratados para cultura de tecidos serão utilizados a fim de reduzir a aderência celular e favorecer o crescimento de tumor-esferas indiferenciadas. Essas condições de cultura selecionam células tumorais imaturas, enquanto células não malignas ou diferenciadas são selecionadas negativamente conforme avaliado para CSCs de origem diferente. As células tumorais imaturas sobreviventes proliferam lentamente dando origem a agregados de células tumorais, "esferas", dentro de 1-2 meses nestas condições de cultura. Células formadoras de esferas podem ser expandidas por dissociação mecânica de esferas, seguida de recolocação de células individuais e pequenos agregados de células residuais em meio fresco completo.

A diferenciação das células formadoras de esferas LC, CRC e BC será obtida por cultivo celular em meio específico (Cambrex). O fenótipo das esferas LC, CRC e BC e sua progênie diferenciada serão analisados ​​por citometria de fluxo ou imunofluorescência. Em particular, serão analisados ​​marcadores de células-tronco como CD133, CD34 e BCRP1.

Sucessivamente, as esferas do câncer serão analisadas para definir o estado das vias envolvidas no processo de proliferação, auto-renovação e sobrevivência. Em particular, a análise específica do tumor será realizada para investigar a atividade e a possível alteração de vias responsáveis ​​pela homeostase das células-tronco e análise global (fosfoproteômica e análise de transdução de sinal, teste de drogas inovadoras, análise de processos de metástase in vivo) com o objetivo de fornecer uma visão geral do estado de ativação das principais vias celulares.

Modelo pré-clínico Usando esferas de câncer, os investigadores irão gerar modelos de xenoenxertos ortotópicos que recapitulam o comportamento do tumor parental, incluindo as características agressivas e o potencial de invasão. A técnica de injeção ortotópica será avaliada em camundongos NOD/SCID com 5 semanas de idade. O procedimento de injeção será feito com o auxílio de um microscópio de dissecação. Após a anestesia, 200 a 500 células cancerígenas modificadas para expressar uma proteína bioluminescente, como a luciferase, serão injetadas usando uma seringa Hamilton e uma agulha de calibre 32. Tumores metastáticos e locais serão comparados quanto ao seu conteúdo de células-tronco por meio de análise fenotípica, como taxa de crescimento ou outras propriedades de células-tronco, incluindo capacidade clonogênica em ágar mole ou por meio de ensaios de diluição limitante. A infecção de CSCs com vetor lentiviral, que codifica para verde fluorescente (GFP), bem como proteínas repórteres de luciferase, permitirá o rastreamento de CSCs in vivo. Em particular, a linha celular de empacotamento anfotrópico 293T será transfectada pelo método cálcio-fosfato/cloroquina. Sobrenadantes de cultura contendo partículas virais serão coletados após 48h de transfecção. A infecção será realizada por cultivo de células-alvo em sobrenadante viral filtrado de 0,45 mícron por 3h em incubadora de CO2. Dois ciclos de infecção serão realizados para infectar as células. A avaliação microscópica da expressão de GFP em embalagens virais e células-alvo será realizada por observação direta das células usando um microscópio de fluorescência reversa equipado com um filtro FITC. Após a infecção, as células transduzidas com luciferase serão separadas por citometria de fluxo para obter uma população marcada pura. O tumor local e o desenvolvimento da invasividade serão monitorizados através de técnicas de imagiologia de corpo inteiro, que permitirão detectar, localizar e quantificar dinamicamente o sinal óptico - bioluminescência - numa localização não invasiva da população celular marcada. Este procedimento será realizado utilizando o sistema de imagem in vivo Photon imager (Biospace Lab), auxiliado pelo software mais recente para aquisição e análise de imagem. Graças a este sistema, recentemente adquirido em laboratório e caracterizado por uma sensibilidade muito elevada e resolução temporal de 20 ms, os investigadores irão analisar animais não anestesiados e em movimento livre. O sinal de bioluminescência será adquirido simultaneamente como um vídeo padrão do animal. Assim que os investigadores tiverem certeza do sucesso do crescimento do tumor, os camundongos serão sacrificados. O tumor será removido para caracterização morfológica e análise fosfoproteômica. Este último será realizado através do microarray de proteínas de fase reversa, que permite obter alto grau de sensibilidade, precisão e linearidade, possibilitando quantificar o estado fosforilado de proteínas sinalizadoras em células imaturas e diferenciadas de câncer de pulmão. Este sistema fornecerá informações sobre vias moleculares específicas envolvidas no crescimento e disseminação de células LC, CRC e BC.

Sensibilidade tumoral a agentes antitumorais Para discriminar seletivamente os compostos terapêuticos eficazes contra o tumor putativo e as células iniciadoras de invasão, os investigadores medirão a viabilidade de CL, CRC e BC clonogênicos após a exposição a vários medicamentos antitumorais combinados diferencialmente em um único momento apontar até 96 horas.