Технико-экономическое обоснование анализа чувствительности стволовых клеток (STELLA)

Пациенты Пациенты с РЛ, КРР и РМЖ с хорошим общим состоянием и с доступной опухолевой тканью, при неэффективности традиционных методов лечения или без возможности лечения с помощью терапии с доказанной эффективностью будут включены в исследование. Первоначальная характеристика пациента будет включать подробную информацию по следующим пунктам: пол, возраст, история болезни, сопутствующие заболевания, физикальное обследование, количество клеток крови, полный анализ крови на функцию печени и почек, коагуляцию, серологические онкомаркеры, локализацию и стадию опухоли, опухолевая масса, метастазы.

Идентификация РСК, КРР и РМЖ Выделение и характеристика РСК будут проводиться, начиная с образцов опухолевой ткани, полученных от пациентов с РЛ, КРР и РМЖ. Опухолевая ткань будет собрана до включения в исследование, т. е. ткань, полученная во время диагностической или терапевтической процедуры, такой как операция или биопсия, с целями, отличными от протокола. Собранные хирургические образцы будут классифицированы в соответствии с конкретными гистологическими характеристиками опухоли. Из каждого образца с помощью ферментативных и механических процедур будут получены РСК, которые затем будут культивироваться в соответствующих культуральных средах для последующего использования в биохимических и молекулярных исследованиях. Каждый образец будет связан с историей болезни пациента во время операции и соответствующей программой последующего наблюдения, состоящей из периодических клинических и инструментальных контролей, чтобы определить прогностическую ценность биологических характеристик CSC. Стволовые клетки, полученные из выбранных эпителиальных опухолей, затем подвергают анализу поверхностных и внутриклеточных маркеров, чтобы дать окончательную характеристику клеточного фенотипа. Стволовые клетки, полученные из рака легкого, CRC и BC, идентифицируют как подмножество опухолевых клеток, положительных по маркеру CD133.

Образцы опухоли промывают несколько раз и оставляют на ночь в среде DMEM:F12 с добавлением высоких доз пенициллина/стрептомицина и фунгизона во избежание загрязнения. Диссоциация ткани будет осуществляться ферментативным расщеплением, а восстановленные клетки культивируются в бессывороточной среде, содержащей 25 мкг/мл инсулина, 100 мкг/мл апо-трансферрина, 10 мкг/мл путресцина, 0,03 мМ селенита натрия, 20 нМ прогестерона, 0,6% глюкозы. , 5 мМ hepes, 0,1% бикарбоната натрия, 0,4% BSA, глутамин и антибиотики, растворенные в среде DMEM-F12 и дополненные 20 нг/мл EGF и 10 нг/мл bFGF. Колбы, необработанные для тканевых культур, будут использоваться для уменьшения прилипания клеток и предпочтительного роста недифференцированных опухолевых сфер. Эти условия культивирования отбирают для незрелых опухолевых клеток, в то время как незлокачественные или дифференцированные клетки отбираются отрицательно при оценке CSC различного происхождения. Выжившие незрелые опухолевые клетки медленно пролиферируют, образуя агрегаты опухолевых клеток, «сферы», в течение 1-2 месяцев в этих условиях культивирования. Сферообразующие клетки могут быть увеличены путем механической диссоциации сфер с последующим повторным посевом одиночных клеток и остаточных агрегатов мелких клеток в полную свежую среду.

Дифференцировка сферообразующих клеток LC, CRC и BC будет получена путем культивирования клеток в специфической среде (Cambrex). Фенотип сфер LC, CRC и BC и их дифференцированное потомство будет проанализирован с помощью проточного цитометрического анализа или иммунофлуоресценции. В частности, будут проанализированы маркеры стволовых клеток, такие как CD133, CD34 и BCRP1.

Последовательно будут проанализированы раковые сферы, чтобы определить состояние путей, участвующих в процессе пролиферации, самообновления и выживания. В частности, будет проведен опухолеспецифический анализ для изучения активности и возможного изменения путей, ответственных за гомеостаз стволовых клеток, и общий анализ (фосфопротеомный анализ и анализ трансдукции сигналов, тестирование инновационных препаратов, анализ процессов метастазирования in vivo), направленный на обеспечение общую картину состояния активации ключевых клеточных путей.

Доклиническая модель Используя раковые сферы, исследователи создадут модели ортотопических ксенотрансплантатов, которые воспроизводят поведение родительской опухоли, включая агрессивные свойства и потенциал инвазивности. Технику ортотопической инъекции будут оценивать на 5-недельных мышах NOD/SCID. Процедура инъекции будет осуществляться с помощью препаровального микроскопа. После анестезии от 200 до 500 раковых сферических клеток, модифицированных для экспрессии биолюминесцентного белка, такого как люцифераза, будут инъецированы с помощью шприца Гамильтона и иглы 32 размера. Метастатические и локальные опухоли будут сравниваться на предмет содержания в них стволовых клеток с помощью фенотипического анализа, такого как скорость роста или другие свойства стволовых клеток, включая клоногенную способность в мягком агаре, или с помощью анализов предельных разведений. Заражение CSC лентивирусным вектором, кодирующим зеленый флуоресцентный (GFP), а также репортерные белки люциферазы, позволит отслеживать CSC in vivo. В частности, амфотропная упаковочная клеточная линия 293T будет трансфицирована кальций-фосфатным/хлорохиновым методом. Культуральные супернатанты, содержащие вирусные частицы, собирают через 48 часов после трансфекции. Заражение будет осуществляться путем культивирования клеток-мишеней в отфильтрованном вирусном супернатанте с размером пор 0,45 мкм в течение 3 часов в инкубаторе с CO2. Для заражения клеток будут выполняться два цикла заражения. Микроскопическая оценка экспрессии GFP в вирусной упаковке и клетках-мишенях будет проводиться путем прямого наблюдения за клетками с использованием микроскопа с обращенной флуоресценцией, оснащенного фильтром FITC. После инфицирования клетки, трансдуцированные люциферазой, будут сортированы с помощью проточной цитометрии для получения чистой маркированной популяции. Локальная опухоль и развитие инвазивности будут отслеживаться с помощью методов визуализации всего тела, что позволит обнаруживать, локализовать и количественно динамически определять оптический сигнал - биолюминесценцию - в неинвазивной локализации отмеченной клеточной популяции. Эта процедура будет выполняться с использованием системы формирования изображений Photon in vivo (Biospace Lab) с использованием новейшего программного обеспечения для получения и анализа изображений. Благодаря этой системе, недавно полученной в лаборатории и характеризующейся очень высокой чувствительностью и временным разрешением 20 мс, исследователи будут анализировать неанестезированных и свободно движущихся животных. Сигнал биолюминесценции будет получен одновременно со стандартным видео животного. Как только исследователи будут уверены в успехе роста опухоли, мышей забьют. Опухоль будет удалена для морфологической характеристики и фосфопротеомного анализа. Это последнее будет выполняться с помощью белкового микрочипа с обращенной фазой, который позволяет достичь высокой степени чувствительности, точности и линейности, позволяя количественно определять фосфорилированный статус сигнальных белков в незрелых и дифференцированных клетках рака легкого. Эта система предоставит информацию о конкретных молекулярных путях, участвующих в росте и распространении клеток LC, CRC и BC.

Чувствительность опухоли к противоопухолевым агентам. Чтобы избирательно различать эффективные терапевтические соединения против предполагаемой опухоли и клеток, инициирующих инвазию, исследователи будут измерять жизнеспособность клоногенных LC, CRC и BC после воздействия нескольких противоопухолевых препаратов, по-разному комбинируемых в одно и то же время. точка до 96 часов.