Studie proveditelnosti testu citlivosti kmenových buněk (STELLA)

Pacienti Do studie budou zařazeni pacienti s LC, CRC a BC s dobrým výkonnostním stavem as dostupnou nádorovou tkání, při selhání konvenční terapie nebo bez možnosti být léčeni terapií s prokázanou účinností. Prvotní charakteristika pacienta bude zahrnovat podrobné informace o následujících položkách: pohlaví, věk, klinická anamnéza, komorbidita, fyzikální vyšetření, počet krvinek, kompletní krevní rozbory pro jaterní a renální funkce, koagulace, sérologické nádorové markery, lokalizace a stadium nádoru, nádorová hmota, metastázy.

Identifikace LC, CRC a BC CSC Izolace a charakterizace CSC bude provedena ze vzorků nádorové tkáně získané od pacientů s LC, CRC a BC. Nádorová tkáň bude odebrána před vstupem do studie, tj. tkáň získaná během diagnostického nebo terapeutického postupu, jako je chirurgický zákrok nebo biopsie s jinými účely, než je protokol. Odebrané chirurgické vzorky budou klasifikovány podle specifických histologických charakteristik nádoru. Z každého vzorku budou pomocí enzymatických a mechanických postupů získány CSC a poté kultivovány v adekvátních kultivačních médiích, které budou následně použity pro biochemické a molekulární studie. Každý vzorek bude spojen s anamnézou pacienta v době chirurgického zákroku a vhodným následným programem sestávajícím z periodických klinických a instrumentálních kontrol, které mají přiřadit prognostickou hodnotu biologickým charakteristikám CSC. Kmenové buňky odvozené z vybraných epiteliálních nádorů pak podstoupí analýzu povrchových a intracelulárních markerů za účelem poskytnutí definitivní charakterizace buněčného fenotypu. Kmenové buňky odvozené z rakoviny plic, CRC a BC jsou identifikovány jako podskupina nádorových buněk pozitivních na marker CD133.

Vzorky nádorů budou několikrát promyty a ponechány přes noc v médiu DMEM:F12 doplněném vysokými dávkami penicilinu/streptomycinu a Fungizone, aby se zabránilo kontaminaci. Disociace tkáně bude provedena enzymatickým štěpením a získané buňky se kultivují v médiu bez séra obsahujícím 25 mikrog/ml inzulínu, 100 mikrog/ml apo-transferinu, 10 mikrog/ml putrescinu, 0,03 mM seleničitanu sodného, ​​20 nM progesteronu, 0,6 % glukózy 5mM hepes, 0,1% hydrogenuhličitan sodný, 0,4% BSA, glutamin a antibiotika, rozpuštěné v médiu DMEM-F12 a doplněné 20 ng/ml EGF a 10 ng/ml bFGF. Pro snížení adherence buněk a oblíbeného růstu nediferencovaných nádorových kuliček budou použity baňky neošetřené pro tkáňové kultury. Tyto kultivační podmínky selektují nezralé nádorové buňky, zatímco nezhoubné nebo diferencované buňky jsou negativně selektovány, jak bylo hodnoceno pro CSC různého původu. Přežívající nezralé nádorové buňky pomalu proliferují za vzniku agregátů nádorových buněk, "sfér", během 1-2 měsíců v těchto kultivačních podmínkách. Sférotvorné buňky mohou být expandovány mechanickou disociací kuliček, následovanou opětovným nanesením jednotlivých buněk a zbytkových malých buněčných agregátů do kompletního čerstvého média.

Diferenciace LC, CRC a BC sférotvorných buněk bude získána kultivací buněk ve specifickém médiu (Cambrex). Fenotyp koulí LC, CRC a BC a jejich diferencované potomstvo bude analyzováno průtokovou cytometrickou analýzou nebo imunofluorescencí. Konkrétně budou analyzovány markery kmenových buněk, jako je CD133, CD34 a BCRP1.

Následně budou analyzovány sféry rakoviny s cílem definovat stav drah zapojených do procesu proliferace, sebeobnovy a přežití. Zejména bude provedena nádorově specifická analýza za účelem prozkoumání aktivity a možné změny drah odpovědných za homeostázu kmenových buněk a globální analýza (fosfoproteomická a signální transdukční analýza, testování inovativních léků, analýza procesů metastatizace in vivo) s cílem poskytnout celkový obraz stavu aktivace klíčových buněčných drah.

Preklinický model Za použití rakovinných koulí budou výzkumníci generovat ortotopické xenoimplantační modely, které rekapitulují rodičovské nádorové chování, včetně agresivních rysů a potenciálu invazivity. Technika ortotopické injekce bude hodnocena u 5 týdnů starých NOD/SCID myší. Vstřikování bude provedeno s podporou pitevního mikroskopu. Po anestetizaci se injekčně podá 200 až 500 rakovinných kulovitých buněk, modifikovaných tak, aby exprimovaly bioluminiscenční protein, jako je luciferáza, pomocí Hamiltonovy stříkačky a jehly o velikosti 32. Metastatické a lokální nádory budou srovnávány na obsah kmenových buněk pomocí fenotypové analýzy, jako je rychlost růstu, nebo jiné vlastnosti kmenových buněk včetně klonogenní kapacity v měkkém agaru nebo pomocí testů limitního ředění. Infekce CSC lentivirovým vektorem, kódujícím zelenou fluorescenci (GFP), stejně jako luciferázové reportérové ​​proteiny, umožní sledování CSC in vivo. Konkrétně amfotropní balicí buněčná linie 293T bude transfekována kalcium-fosfátovou/chlorochinovou metodou. Kultivační supernatanty obsahující virové částice budou odebrány po 48 hodinách transfekce. Infekce bude provedena kultivací cílových buněk v 0,45 mikrom filtrovaném virovém supernatantu po dobu 3 hodin v CO2 inkubátoru. K infekci buněk budou provedeny dva infekční cykly. Mikroskopické hodnocení exprese GFP ve virovém balení a cílových buňkách bude provedeno přímým pozorováním buněk pomocí reverzního fluorescenčního mikroskopu vybaveného filtrem FITC. Po infekci budou buňky transdukované luciferázou tříděny průtokovou cytometrií, aby se získala čistá označená populace. Lokální nádor a vývoj invazivity bude sledován celotělovými zobrazovacími technikami, které umožní detekovat, lokalizovat a dynamicky kvantifikovat optický signál - bioluminiscenci - v neinvazivní lokalizaci označené buněčné populace. Tento postup bude proveden pomocí zobrazovacího systému Photon in vivo (Biospace Lab), s pomocí nejnovějšího softwaru pro získávání a analýzu obrazu. Díky tomuto systému, který byl nedávno pořízen v laboratoři a vyznačuje se velmi vysokou citlivostí a časovým rozlišením 20 ms, budou vyšetřovatelé analyzovat neanestetizovaná a volně se pohybující zvířata. Bioluminiscenční signál bude pořízen současně jako standardní video zvířete. Jakmile si budou vyšetřovatelé jisti úspěchem růstu nádoru, myši budou usmrceny. Nádor bude odstraněn pro morfologickou charakterizaci a fosfoproteomickou analýzu. To bude prováděno prostřednictvím proteinového mikročipu s reverzní fází, který umožňuje dosažení vysokého stupně citlivosti, přesnosti a linearity, což umožňuje kvantifikovat fosforylovaný stav signálních proteinů v nezralých a diferencovaných buňkách rakoviny plic. Tento systém bude poskytovat informace o specifických molekulárních drahách zapojených do růstu a šíření buněk LC, CRC a BC.

Citlivost nádoru na protinádorová činidla Aby bylo možné selektivně rozlišit účinné terapeutické sloučeniny proti domnělému nádoru a buňkám iniciujícím invazi, budou výzkumníci měřit životaschopnost klonogenních LC, CRC a BC po expozici několika protinádorovým lékům odlišně kombinovaným v jediném čase. bod až 96 hodin.