Kantasolujen herkkyysmäärityksen toteutettavuustutkimus (STELLA)

Potilaat Tutkimukseen otetaan mukaan LC-, CRC- ja BC-potilaat, joilla on hyvä suorituskyky ja kasvainkudosta saatavilla, jos tavanomaiset hoidot epäonnistuvat tai joilla ei ole mahdollisuutta saada hoitoa todistetusti tehokkaalla hoidolla. Potilaan alustava karakterisointi sisältää yksityiskohtaisia ​​tietoja seuraavista seikoista: sukupuoli, ikä, kliininen historia, samanaikainen sairaus, fyysinen tutkimus, verisolujen määrä, täydelliset verianalyysit maksan ja munuaisten toiminnan varalta, koagulaatiosta, serologisista kasvainmarkkereista, kasvaimen sijainti ja vaihe, kasvainmassa, etäpesäkkeet.

LC, CRC ja BC CSC:iden tunnistaminen CSC:iden eristäminen ja karakterisointi tehdään alkaen kasvainkudosnäytteistä, jotka on otettu potilailta, joilla on LC, CRC ja BC. Kasvainkudos kerätään ennen tutkimukseen tuloa, eli kudos, joka on saatu diagnostisen tai terapeuttisen toimenpiteen, kuten leikkauksen tai biopsioiden, aikana muuhun tarkoitukseen kuin protokollaan. Kerätyt kirurgiset näytteet luokitellaan kasvaimen erityisten histologisten ominaisuuksien mukaan. Jokaisesta näytteestä saadaan entsymaattisten ja mekaanisten menetelmien avulla CSC:t, joita viljellään sitten sopivissa viljelyalustassa käytettäväksi myöhemmin biokemiallisiin ja molekyylitutkimuksiin. Jokainen näyte liitetään potilaan historiaan leikkaushetkellä ja asianmukaiseen seurantaohjelmaan, joka koostuu säännöllisistä kliinisistä ja instrumentaalisista kontrolleista, joiden avulla CSC:iden biologisille ominaisuuksille voidaan määrittää ennustearvo. Valituista epiteelisuumoreista peräisin oleville kantasoluille suoritetaan sitten pinta- ja solunsisäisten markkerien analyysi, jotta saadaan aikaan solufenotyypin lopullinen karakterisointi. Keuhkosyövästä, CRC:stä ja BC:stä peräisin olevat kantasolut tunnistetaan kasvainsolujen alajoukoksi, jotka ovat positiivisia markkerille CD133.

Kasvainnäytteet pestään useita kertoja ja jätetään yön yli DMEM:F12-elatusaineeseen, johon on lisätty suuria annoksia penisilliiniä/streptomysiiniä ja fungitsonia kontaminoitumisen välttämiseksi. Kudosten dissosiaatio suoritetaan entsymaattisella digestiolla ja talteen otettuja soluja viljellään seerumittomassa alustassa, joka sisältää 25 mikrog/ml insuliinia, 100 mikrog/ml apo-transferriiniä, 10 mikrog/ml putreskiinia, 0,03 mM natriumseleniittiä, 20 nM progesteronia, 0,6 % glukoosia. 5 mM hepes, 0,1 % natriumbikarbonaatti, 0,4 % BSA, glutamiini ja antibiootit, liuotettuna DMEM-F12-elatusaineeseen ja täydennettynä 20 ng/ml EGF:llä ja 10 ng/ml bFGF:llä. Kudosviljelyä varten käsittelemättömiä pulloja käytetään vähentämään solujen kiinnittymistä ja erilaistumattomien kasvainpallojen suosikkikasvua. Nämä viljelyolosuhteet valikoivat epäkypsät kasvainsolut, kun taas ei-pahanlaatuiset tai erilaistuneet solut valitaan negatiivisesti eri alkuperää olevien CSC:iden suhteen. Eloonjääneet epäkypsät kasvainsolut proliferoituvat hitaasti aiheuttaen kasvainsoluaggregaatteja, "palloja" 1-2 kuukauden kuluessa näissä viljelyolosuhteissa. Palloa muodostavia soluja voidaan laajentaa pallojen mekaanisella dissosiaatiolla, minkä jälkeen yksittäiset solut ja jäljelle jääneet piensoluaggregaatit maljataan uudelleen täydelliseen tuoreeseen väliaineeseen.

LC-, CRC- ja BC-palloja muodostavien solujen erilaistuminen saadaan aikaan soluviljelmällä tietyssä väliaineessa (Cambrex). LC-, CRC- ja BC-pallojen ja niiden erilaistuneiden jälkeläisten fenotyyppi analysoidaan virtaussytometrisellä analyysillä tai immunofluoresenssilla. Erityisesti analysoidaan kantasolumarkkereita, kuten CD133, CD34 ja BCRP1.

Syöpäsfäärejä analysoidaan peräkkäin, jotta voidaan määritellä leviämis-, uusiutumis- ja eloonjäämisprosessiin osallistuvien reittien tila. Erityisesti tehdään kasvainspesifinen analyysi kantasolujen homeostaasista ja globaalista analyysistä (fosfoproteominen ja signaalinvälitysanalyysi, innovatiiviset lääketutkimukset, metastasoitumisprosessien analyysi in vivo) vaikuttavien reittien aktiivisuuden ja mahdollisen muutoksen tutkimiseksi. yleiskuva tärkeimpien solupolkujen aktivaatiotilasta.

Prekliininen malli Syöpäsfäärejä käyttämällä tutkijat luovat ortotooppisia ksenograftimalleja, jotka kuvaavat vanhempien kasvaimen käyttäytymistä, mukaan lukien aggressiiviset ominaisuudet ja invasiivisuuspotentiaali. Ortotooppinen injektiotekniikka arvioidaan 5 viikon ikäisillä NOD/SCID-hiirillä. Injektiotoimenpiteet tehdään dissektoivan mikroskoopin tuella. Nukutuksen jälkeen 200-500 syöpäpallon solua, jotka on modifioitu ekspressoimaan bioluminesoivaa proteiinia, kuten lusiferaasia, ruiskutetaan käyttämällä Hamilton-ruiskua ja 32 gaugen neulaa. Metastaattisia ja paikallisia kasvaimia verrataan niiden kantasolupitoisuuden suhteen fenotyyppianalyysin, kuten kasvunopeuden, tai muiden kantasolujen ominaisuuksien avulla, mukaan lukien klonogeeninen kapasiteetti pehmeässä agarissa, tai rajoittavien laimennusmääritysten avulla. CSC:iden infektio lentivirusvektorilla, joka koodaa vihreää fluoresenssia (GFP) sekä lusiferaasireportteriproteiineja, mahdollistaa CSC:iden seurannan in vivo. Erityisesti amfotrooppinen pakkaussolulinja 293T transfektoidaan kalsiumfosfaatti/klorokiini-menetelmällä. Viruspartikkeleita sisältävät viljelmän supernatantit kerätään 48 tunnin transfektion jälkeen. Infektio suoritetaan viljelemällä kohdesoluja 0,45 mikrometrin suodatetussa virussupernatantissa 3 tunnin ajan CO2-inkubaattorissa. Solujen infektoimiseksi suoritetaan kaksi infektiosykliä. GFP:n ilmentymisen mikroskooppinen arviointi viruspakkauksessa ja kohdesoluissa suoritetaan tarkkailemalla soluja suoraan käyttämällä FITC-suodattimella varustettua käänteistä fluoresenssimikroskooppia. Infektoinnin jälkeen lusiferaasilla transdusoidut solut lajitellaan virtaussytometrialla puhtaan leimatun populaation saamiseksi. Paikallista kasvainta ja invasiivisuuden kehitystä seurataan koko kehon kuvantamistekniikoilla, jotka mahdollistavat optisen signaalin - bioluminesenssin - dynaamisen havaitsemisen, paikantamisen ja kvantifioinnin merkityn solupopulaation ei-invasiivisessa sijainnissa. Tämä toimenpide suoritetaan käyttämällä Photon Imager in vivo -kuvausjärjestelmää (Biospace Lab), jota avustaa uusin ohjelmisto hankintaan ja kuvan analysointiin. Tämän järjestelmän ansiosta, joka hankittiin äskettäin laboratoriosta ja jolle on ominaista erittäin korkea herkkyys ja 20 ms ajallinen resoluutio, tutkijat analysoivat nukuttamattomia ja vapaasti liikkuvia eläimiä. Bioluminesenssisignaali saadaan samanaikaisesti standardinmukaisena videona eläimestä. Kun tutkijat ovat varmoja kasvaimen kasvun onnistumisesta, hiiret lopetetaan. Kasvain poistetaan morfologista karakterisointia ja fosfoproteomista analyysiä varten. Tämä jälkimmäinen suoritetaan käänteisfaasiproteiinin mikrosirulla, joka mahdollistaa korkean herkkyyden, tarkkuuden ja lineaarisuuden saavuttamisen, mikä mahdollistaa signaaliproteiinien fosforyloituneen tilan kvantifioinnin epäkypsissä ja erilaistuneissa keuhkosyöpäsoluissa. Tämä järjestelmä tarjoaa tietoa tietyistä molekyylireiteistä, jotka liittyvät LC-, CRC- ja BC-solujen kasvuun ja leviämiseen.

Kasvaimen herkkyys antituumoriaineille Erotellakseen selektiivisesti tehokkaat terapeuttiset yhdisteet oletettua kasvainta ja invaasiota aloittavia soluja vastaan ​​tutkijat mittaavat klonogeenisten LC-, CRC- ja BC-solujen elinkelpoisuuden sen jälkeen, kun ne on altistettu useille kasvainlääkkeille, jotka on yhdistetty eri tavalla yksittäisenä aikana. piste jopa 96 tuntia.