Gjennomførbarhetsstudie på stamcellesensitivitetsanalyse (STELLA)

Pasienter Pasienter med LC, CRC og BC med god ytelsesstatus og med tumorvev tilgjengelig, ved svikt i konvensjonelle terapier eller uten mulighet for å bli behandlet med terapi med påvist effekt, vil bli inkludert i studien. Innledende pasientkarakterisering vil inkludere detaljert informasjon om følgende elementer: kjønn, alder, klinisk historie, komorbiditet, fysisk undersøkelse, blodcelletall, komplette blodanalyser for lever- og nyrefunksjon, koagulasjon, serologiske tumormarkører, tumorplassering og stadium, tumormasse, metastaser.

LC, CRC og BC CSCs identifikasjon Isolering og karakterisering av CSCs vil bli gjort med utgangspunkt i prøver av tumorvev hentet fra pasienter med LC, CRC og BC. Tumorvev vil bli samlet inn før studiestart, dvs. vev oppnådd under en diagnostisk eller terapeutisk prosedyre, som kirurgi eller biopsier med andre formål enn protokollen. De kirurgiske prøvene som samles inn vil bli klassifisert i henhold til de spesifikke histologiske egenskapene til svulsten. Fra hver prøve, ved hjelp av enzymatiske og mekaniske prosedyrer, vil CSC-ene bli oppnådd og deretter dyrket i passende kulturmedier for deretter å bli brukt til biokjemiske og molekylære studier. Hver prøve vil bli assosiert med pasienthistorien på det kirurgiske tidspunktet og et passende oppfølgingsprogram bestående av periodiske kliniske og instrumentelle kontroller som for å tildele en prognostisk verdi til de biologiske egenskapene til CSCs. Stamceller avledet fra de utvalgte epiteliale svulstene vil deretter gjennomgå analyse av overflate- og intracellulære markører for å gi en definitiv karakterisering av cellulær fenotype. Stamceller avledet fra lungekreft, CRC og BC er identifisert som en undergruppe av tumorceller som er positive for markøren CD133.

Tumorprøver vil vaskes flere ganger og legges over natten i DMEM:F12-medium supplert med høye doser av Penicillin/Streptomycin og Fungizon for å unngå kontaminering. Vevsdissosiasjon vil bli utført ved enzymatisk fordøyelse og gjenvunne celler dyrket i serumfritt medium som inneholder 25 mikrog/ml insulin, 100 mikrog/ml apo-transferrin, 10 mikrog/ml putrescin, 0,03 mM natriumselenitt, 20nM progesteron, 06 % glukose. , 5 mM hepes, 0,1 % natriumbikarbonat, 0,4 % BSA, glutamin og antibiotika, oppløst i DMEM-F12-medium og supplert med 20 ng/ml EGF og 10 ng/ml bFGF. Flasker som ikke er behandlet for vevskultur vil bli brukt for å redusere cellevedheft og favorittvekst av udifferensierte tumorkuler. Disse kulturbetingelsene selekterer for umodne tumorceller, mens ikke-maligne eller differensierte celler er negativt selektert som vurdert for CSCer av forskjellig opprinnelse. Overlevende umodne tumorceller prolifererer sakte og gir opphav til tumorcelleaggregater, "sfærer", i løpet av 1-2 måneder under disse kulturbetingelsene. Sfæredannende celler kan utvides ved mekanisk dissosiasjon av sfærer, etterfulgt av re-plettering av enkeltceller og gjenværende småcelleaggregater i komplett ferskt medium.

Differensiering av LC, CRC og BC sfæredannende celler vil bli oppnådd ved cellekultur i spesifikt medium (Cambrex). Fenotypen av LC, CRC og BC sfærer og deres differensierte avkom vil bli analysert ved flowcytometrisk analyse eller immunfluorescens. Spesielt vil stamcellemarkører som CD133, CD34 og BCRP1 bli analysert.

Suksessivt vil kreftsfærer bli analysert for å definere statusen til veier involvert i prosessen med spredning, selvfornyelse og overlevelse. Spesielt vil tumorspesifikk analyse bli utført for å undersøke aktiviteten og den mulige endringen av veier som er ansvarlige for stamcellehomeostase og global analyse (fosfoproteomisk og signaltransduksjonsanalyse, innovativ medikamenttesting, analyse av prosesser metastatisering in vivo) som har som mål å gi et helhetlig bilde av aktiveringstilstanden til de sentrale cellulære banene.

Preklinisk modell Ved å bruke kreftsfærer vil etterforskerne generere ortotopiske xenograft-modeller som rekapitulerer foreldrenes tumoratferd, inkludert de aggressive egenskapene og invasivitetspotensialet. Ortotopisk injeksjonsteknikk vil bli vurdert i 5 uker gamle NOD/SCID-mus. Injeksjonsprosedyren vil bli utført med støtte fra et dissekeringsmikroskop. Etter bedøvelse vil 200 til 500 kreftsfæreceller, modifisert for å uttrykke et bioluminescerende protein som luciferase, injiseres ved hjelp av en Hamilton-sprøyte og 32-gauge nål. Metastatiske og lokale svulster vil bli sammenlignet for deres stamcelleinnhold gjennom fenotypisk analyse som veksthastighet, eller andre stamcelleegenskaper inkludert klonogen kapasitet i myk agar eller gjennom begrensende fortynningsanalyser. Infeksjon av CSC-er med lentiviral vektor, som koder for grønn fluorescerende (GFP), samt luciferase-reporterproteiner, vil tillate CSC-sporing in vivo. Spesielt vil den amfotropiske pakkecellelinjen 293T bli transfektert med kalsium-fosfat/klorokin-metoden. Kultursupernatanter som inneholder virale partikler vil bli samlet etter 48 timers transfeksjon. Infeksjon vil bli utført ved å dyrke målceller i 0,45 mikrom filtrert viral supernatant i 3 timer i en CO2-inkubator. To infeksjonssykluser vil bli utført for å infisere celler. Mikroskopisk evaluering av GFP-ekspresjon i viral pakking og målceller vil bli utført ved direkte observasjon av celler ved bruk av et reversert fluorescensmikroskop utstyrt med et FITC-filter. Etter infeksjon vil celler transdusert med luciferase sorteres ved flowcytometri for å oppnå en ren markert populasjon. Den lokale svulsten og utviklingen av invasivitet vil bli overvåket gjennom helkroppsavbildningsteknikker, som vil tillate å oppdage, lokalisere og kvantifisere dynamisk det optiske signalet - bioluminescens - i en ikke-invasiv lokalisering av den markerte cellepopulasjonen. Denne prosedyren vil bli utført ved hjelp av Photon imager in vivo bildebehandlingssystem (Biospace Lab), assistert av den nyeste programvaren for innsamling og bildeanalyse. Takket være dette systemet, ble det nylig anskaffet i laboratoriet og preget av en svært høy følsomhet og 20 ms tidsmessig oppløsning, vil etterforskerne analysere ikke-bedøvede og fritt bevegelige dyr. Bioluminescenssignalet vil bli innhentet samtidig som en standard video av dyret. Når etterforskerne er sikre på suksessen med tumorvekst, vil mus bli ofret. Tumor vil bli fjernet for morfologisk karakterisering og fosfoproteomisk analyse. Dette sistnevnte vil bli utført gjennom omvendt fase proteinmikroarray, som gjør det mulig å oppnå en høy grad av sensitivitet, presisjon og linearitet, noe som gjør det mulig å kvantifisere den fosforylerte statusen til signalproteiner i umodne og differensierte lungekreftceller. Dette systemet vil gi informasjon om spesifikke molekylære veier involvert i LC, CRC og BC cellevekst og spredning.

Tumorfølsomhet overfor antitumormidler For selektivt å skille de effektive terapeutiske forbindelsene mot de antatte tumor- og invasjonsinitierende cellene, vil etterforskerne måle levedyktigheten til klonogen LC, CRC og BC etter eksponering for flere antitumormedisiner differensielt kombinert på enkelt tidspunkt punkt opp til 96 timer.