줄기세포 민감도 분석에 대한 타당성 조사 (STELLA)

환자 수행 상태가 양호하고 종양 조직이 있고 기존 요법이 실패했거나 효능이 입증된 요법으로 치료할 가능성이 없는 LC, CRC 및 BC 환자가 연구에 포함됩니다. 초기 환자 특성화에는 다음 항목에 대한 자세한 정보가 포함됩니다. 성별, 연령, 임상 병력, 동반 질환, 신체 검사, 혈구 수, 간 및 신장 기능에 대한 완전한 혈액 분석, 응고, 혈청학적 종양 표지자, 종양 위치 및 병기, 종양 덩어리, 전이.

LC, CRC 및 BC CSC 식별 CSC의 분리 및 특성화는 LC, CRC 및 BC 환자로부터 얻은 종양 조직 샘플에서 시작하여 이루어집니다. 종양 조직은 연구 시작 전에 수집될 것입니다. 즉, 프로토콜 이외의 다른 목적을 가진 수술 또는 생검과 같은 진단 또는 치료 절차 중에 얻은 조직입니다. 수집된 수술 샘플은 종양의 특정 조직학적 특성에 따라 분류됩니다. 각 샘플에서 효소 및 기계적 절차를 통해 CSC를 얻은 다음 생화학 및 분자 연구에 사용할 적절한 배양 배지에서 배양합니다. 각 샘플은 수술 시간의 환자 병력 및 CSC의 생물학적 특성에 대한 예후 가치를 할당하기 위해 주기적인 임상 및 도구 제어로 구성된 적절한 추적 프로그램과 연관됩니다. 선택된 상피 종양에서 유래된 줄기 세포는 세포 표현형의 결정적인 특성을 제공하기 위해 표면 및 세포내 마커의 분석을 거칠 것입니다. 폐암, CRC 및 BC에서 파생된 줄기 세포는 마커 CD133에 대해 양성인 종양 세포의 하위 집합으로 식별됩니다.

종양 표본은 오염을 피하기 위해 고용량의 페니실린/스트렙토마이신 및 Fungizone이 보충된 DMEM:F12 배지에서 여러 번 세척하고 밤새 방치합니다. 조직 해리는 25 microg/ml 인슐린, 100 microg/ml 아포-트랜스페린, 10 microg/ml 퓨트레신, 0.03 mM 셀레나이트 나트륨, 20nM 프로게스테론, 0.6% 포도당을 포함하는 무혈청 배지에서 배양된 효소 소화 및 회수된 세포에 의해 수행됩니다. , 5mM hepes, 0.1% 중탄산나트륨, 0.4% BSA, 글루타민 및 항생제, DMEM-F12 배지에 용해되고 20ng/ml EGF 및 10ng/ml bFGF로 보충됨. 조직 배양을 위해 처리되지 않은 플라스크는 미분화 종양 구의 세포 부착 및 좋아하는 성장을 줄이기 위해 사용됩니다. 이러한 배양 조건은 미성숙 종양 세포를 선택하는 반면, 비악성 또는 분화 세포는 다른 기원의 CSC에 대해 평가할 때 부정적으로 선택합니다. 생존하는 미성숙 종양 세포는 천천히 증식하여 이러한 배양 조건에서 1-2개월 이내에 종양 세포 응집체, "구체"를 생성합니다. 구체 형성 세포는 구체의 기계적 해리에 의해 확장될 수 있으며, 그 다음 완전한 신선한 배지에서 단일 세포 및 잔류 작은 세포 집합체를 다시 도금할 수 있습니다.

LC, CRC 및 BC 구형 형성 세포의 분화는 특정 배지(Cambrex)에서의 세포 배양에 의해 얻어질 것이다. LC, CRC 및 BC 구체의 표현형 및 이들의 분화된 자손은 유동 세포측정 분석 또는 면역형광에 의해 분석될 것이다. 특히 CD133, CD34 및 BCRP1과 같은 줄기 세포 마커가 분석됩니다.

계속해서 암 영역을 분석하여 증식, 자가 재생 및 생존 과정과 관련된 경로의 상태를 정의합니다. 특히 종양 특이적 분석을 통해 줄기세포 항상성을 담당하는 경로의 활성 및 변경 가능성을 조사하고 글로벌 분석(인단백체 및 신호 전달 분석, 혁신적인 약물 테스트, 생체 내 전이 과정 분석)을 제공할 예정입니다. 주요 세포 경로의 활성화 상태에 대한 전반적인 그림.

전임상 모델 암 영역을 사용하여 연구자들은 공격적인 특징과 침습 가능성을 포함하여 부모 종양 행동을 재현하는 정위 이종 이식 모델을 생성할 것입니다. 정위 주사 기술은 5주된 NOD/SCID 마우스에서 평가될 것이다. 주입 절차는 해부 현미경의 지원으로 수행됩니다. 마취 후 루시페라제와 같은 생물발광 단백질을 발현하도록 변형된 200~500개의 암 구체 세포를 해밀턴 주사기와 32게이지 바늘을 사용하여 주입합니다. 전이성 및 국소 종양은 성장 속도와 같은 표현형 분석 또는 부드러운 한천에서의 클론 생성 능력을 포함한 기타 줄기 세포 특성 또는 제한 희석 분석을 통해 줄기 세포 함량에 대해 비교됩니다. 녹색 형광(GFP) 및 루시퍼라제 리포터 단백질을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 CSC를 감염시키면 CSC가 생체 내에서 추적할 수 있습니다. 특히 amphotropic packaging 세포주 293T는 calcium-phosphate/chloroquine법으로 transfection할 예정이다. 바이러스 입자를 포함하는 배양 상청액은 형질감염 48시간 후에 수집됩니다. 감염은 CO2 인큐베이터에서 3시간 동안 0.45 microm 여과된 바이러스 상청액에서 표적 세포를 배양하여 수행됩니다. 세포를 감염시키기 위해 두 번의 감염 주기가 수행됩니다. 바이러스 패키징 및 표적 세포에서 GFP 발현의 현미경 평가는 FITC 필터가 장착된 역 형광 현미경을 사용하여 세포를 직접 관찰하여 수행됩니다. 감염 후, 루시페라아제로 변환된 세포는 유동 세포측정법으로 분류되어 순수한 표시된 집단을 얻습니다. 국소 종양 및 침습성 발달은 표시된 세포 집단의 비침습적 국소화에서 광학 신호(생물발광)를 동적으로 감지, 국소화 및 정량화할 수 있는 전신 이미징 기술을 통해 모니터링됩니다. 이 절차는 획득 및 이미지 분석을 위한 최신 소프트웨어의 지원을 받는 생체 내 이미징 시스템(Biospace Lab)의 Photon 이미저를 사용하여 수행됩니다. 이 시스템 덕분에 최근에 실험실에서 획득했으며 매우 높은 감도와 20ms의 시간 분해능을 특징으로 하며 조사관은 마취되지 않고 자유롭게 움직이는 동물을 분석할 것입니다. 생물 발광 신호는 동물의 표준 비디오로 동시에 획득됩니다. 조사관이 종양 성장의 성공을 확신하면 마우스를 희생시킬 것입니다. 종양은 형태학적 특성화 및 인단백질 분석을 위해 제거됩니다. 후자는 미성숙하고 분화된 폐암 세포에서 신호 단백질의 인산화 상태를 정량화할 수 있도록 높은 수준의 감도, 정밀도 및 선형성을 달성할 수 있는 역상 단백질 마이크로어레이를 통해 수행됩니다. 이 시스템은 LC, CRC 및 BC 세포 성장 및 퍼짐과 관련된 특정 분자 경로에 대한 정보를 제공합니다.

항종양제에 대한 종양 민감성 추정 종양 및 침입 개시 세포에 대한 효과적인 치료 화합물을 선택적으로 구별하기 위해 연구자는 단일 시간에 차별적으로 결합된 여러 항종양제에 노출된 후 클론원성 LC, CRC 및 BC의 생존력을 측정할 것입니다. 최대 96시간을 가리킵니다.