Studium wykonalności dotyczące testu wrażliwości komórek macierzystych (STELLA)

Pacjenci Pacjenci z LC, CRC i BC w dobrym stanie ogólnym, z dostępną tkanką nowotworową, w przypadku niepowodzenia terapii konwencjonalnych lub bez możliwości leczenia terapią o udowodnionej skuteczności, zostaną włączeni do badania. Wstępna charakterystyka pacjenta będzie zawierała szczegółowe informacje na temat następujących elementów: płeć, wiek, historia kliniczna, choroby współistniejące, badanie fizykalne, morfologia krwi, pełna analiza krwi pod kątem czynności wątroby i nerek, krzepliwość, serologiczne markery nowotworowe, lokalizacja i stopień zaawansowania nowotworu, masa guza, przerzuty.

Identyfikacja CSC LC, CRC i BC Izolacja i charakterystyka CSC zostanie przeprowadzona z próbek tkanki nowotworowej pobranych od pacjentów z LC, CRC i BC. Tkanka guza zostanie pobrana przed włączeniem do badania, tj. tkanka uzyskana podczas procedury diagnostycznej lub terapeutycznej, takiej jak zabieg chirurgiczny lub biopsja w celach innych niż protokół. Zebrane próbki chirurgiczne zostaną sklasyfikowane zgodnie z określonymi cechami histologicznymi guza. Z każdej próbki, za pomocą procedur enzymatycznych i mechanicznych, zostaną pozyskane CSC, które następnie będą hodowane w odpowiednich pożywkach hodowlanych, które następnie będą wykorzystywane do badań biochemicznych i molekularnych. Każda próbka będzie powiązana z historią pacjenta w czasie operacji i odpowiednim programem obserwacji składającym się z okresowych kontroli klinicznych i instrumentalnych, które mają na celu przypisanie wartości prognostycznej biologicznej charakterystyce CSC. Komórki macierzyste pochodzące z wybranych guzów nabłonkowych zostaną następnie poddane analizie markerów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych w celu ostatecznego scharakteryzowania fenotypu komórkowego. Komórki macierzyste pochodzące z raka płuc, CRC i BC są identyfikowane jako podzbiór komórek nowotworowych dodatnich pod względem markera CD133.

Próbki guzów zostaną przemyte kilka razy i pozostawione na noc w podłożu DMEM:F12 uzupełnionym wysokimi dawkami penicyliny/streptomycyny i fungizone w celu uniknięcia kontaminacji. Dysocjacja tkanki zostanie przeprowadzona poprzez trawienie enzymatyczne, a odzyskane komórki będą hodowane w pożywce bez surowicy zawierającej 25 mikrogramów/ml insuliny, 100 mikrogramów/ml apotransferyny, 10 mikrogramów/ml putrescyny, 0,03 mM selenianu sodu, 20 nM progesteronu, 0,6% glukozy , 5 mM hepes, 0,1% wodorowęglanu sodu, 0,4% BSA, glutaminy i antybiotyków, rozpuszczonych w pożywce DMEM-F12 i uzupełnionych 20 ng/ml EGF i 10 ng/ml bFGF. Kolby nietraktowane do hodowli tkankowej zostaną użyte w celu zmniejszenia adhezji komórek i ulubionego wzrostu niezróżnicowanych sfer guza. Te warunki hodowli selekcjonują niedojrzałe komórki nowotworowe, podczas gdy niezłośliwe lub zróżnicowane komórki są selekcjonowane negatywnie, co ocenia się pod kątem CSC różnego pochodzenia. Przeżywające niedojrzałe komórki nowotworowe powoli proliferują, tworząc agregaty komórek nowotworowych, „sfery”, w ciągu 1-2 miesięcy w tych warunkach hodowli. Komórki tworzące sfery można namnażać przez mechaniczną dysocjację kulek, a następnie ponowne wysiewanie pojedynczych komórek i resztkowych agregatów małych komórek w kompletnej świeżej pożywce.

Różnicowanie komórek tworzących sfery LC, CRC i BC zostanie uzyskane poprzez hodowlę komórek w określonej pożywce (Cambrex). Fenotyp kulek LC, CRC i BC oraz ich zróżnicowanego potomstwa będzie analizowany metodą cytometrii przepływowej lub immunofluorescencji. W szczególności analizowane będą markery komórek macierzystych, takie jak CD133, CD34 i BCRP1.

Sukcesywnie analizowane będą sfery nowotworowe w celu określenia stanu szlaków zaangażowanych w proces proliferacji, samoodnawiania i przeżycia. W szczególności przeprowadzona zostanie analiza specyficzna dla guza w celu zbadania aktywności i możliwych zmian szlaków odpowiedzialnych za homeostazę komórek macierzystych oraz analiza globalna (analiza fosfoproteomiczna i transdukcji sygnału, testowanie innowacyjnych leków, analiza procesów przerzutowania in vivo) mająca na celu zapewnienie ogólny obraz stanu aktywacji kluczowych szlaków komórkowych.

Model przedkliniczny Wykorzystując sfery raka, badacze wygenerują ortotopowe modele ksenoprzeszczepów, które podsumowują zachowanie guza macierzystego, w tym cechy agresywne i potencjał inwazyjności. Technika iniekcji ortotopowej zostanie oceniona na 5-tygodniowych myszach NOD/SCID. Procedura wstrzyknięcia zostanie wykonana przy pomocy mikroskopu preparacyjnego. Po znieczuleniu, 200 do 500 kulistych komórek nowotworowych, zmodyfikowanych w celu ekspresji białka bioluminescencyjnego, takiego jak lucyferaza, zostanie wstrzykniętych za pomocą strzykawki Hamiltona i igły 32 G. Guzy przerzutowe i miejscowe zostaną porównane pod kątem zawartości komórek macierzystych poprzez analizę fenotypową, taką jak tempo wzrostu lub inne właściwości komórek macierzystych, w tym zdolność klonogenną w miękkim agarze lub poprzez testy granicznych rozcieńczeń. Zakażenie CSC wektorem lentiwirusowym, kodującym zieloną fluorescencję (GFP), a także białkami reporterowymi lucyferazy, umożliwi śledzenie CSC in vivo. W szczególności linia komórkowa pakująca amfotropowo 293T będzie transfekowana metodą fosforanu wapnia/chlorochiny. Supernatanty z hodowli zawierające cząsteczki wirusowe zostaną zebrane po 48 godzinach transfekcji. Zakażenie zostanie przeprowadzone przez hodowlę komórek docelowych w supernatancie wirusowym filtrowanym przez filtr 0,45 mikrometra przez 3 godziny w inkubatorze z CO2. W celu zainfekowania komórek zostaną przeprowadzone dwa cykle infekcji. Mikroskopowa ocena ekspresji GFP w wirusach pakujących i komórkach docelowych zostanie przeprowadzona poprzez bezpośrednią obserwację komórek przy użyciu mikroskopu z odwróconą fluorescencją wyposażonego w filtr FITC. Po zakażeniu komórki transdukowane lucyferazą będą sortowane za pomocą cytometrii przepływowej w celu uzyskania czystej oznaczonej populacji. Lokalny guz i rozwój inwazyjności będą monitorowane za pomocą technik obrazowania całego ciała, które pozwolą wykryć, zlokalizować i dynamicznie określić ilościowo sygnał optyczny - bioluminescencję - w nieinwazyjnej lokalizacji oznaczonej populacji komórek. Procedura ta zostanie przeprowadzona przy użyciu systemu obrazowania in vivo Photon Imager (Biospace Lab), wspomaganego najnowszym oprogramowaniem do akwizycji i analizy obrazów. Dzięki temu systemowi, który został niedawno pozyskany w laboratorium i charakteryzuje się bardzo dużą czułością oraz rozdzielczością czasową 20 ms, badacze będą analizować nieuśpione i swobodnie poruszające się zwierzęta. Sygnał bioluminescencji zostanie pobrany jednocześnie jako standardowe wideo zwierzęcia. Gdy badacze będą pewni sukcesu wzrostu guza, myszy zostaną uśmiercone. Guz zostanie usunięty w celu charakterystyki morfologicznej i analizy fosfoproteomicznej. To ostatnie zostanie przeprowadzone za pomocą mikromacierzy białkowej z odwróconą fazą, która pozwala osiągnąć wysoki stopień czułości, precyzji i liniowości, umożliwiając ilościowe określenie stanu ufosforylowania białek sygnałowych w niedojrzałych i zróżnicowanych komórkach raka płuca. System ten dostarczy informacji na temat określonych szlaków molekularnych zaangażowanych we wzrost i rozprzestrzenianie się komórek LC, CRC i BC.

Wrażliwość guza na środki przeciwnowotworowe Aby selektywnie rozróżnić skuteczne związki terapeutyczne przeciwko domniemanemu nowotworowi i komórkom inicjującym inwazję, badacze zmierzą żywotność klonogennych LC, CRC i BC po ekspozycji na kilka leków przeciwnowotworowych różnie połączonych w pojedynczym czasie wskazuje do 96 godzin.