Gennemførlighedsundersøgelse af stamcellefølsomhedsanalyse (STELLA)

Patienter Patienter med LC, CRC og BC med god præstationsstatus og med tumorvæv tilgængeligt, ved svigt af konventionelle terapier eller uden mulighed for at blive behandlet med terapi med dokumenteret effekt, vil blive inkluderet i undersøgelsen. Den indledende patientkarakterisering vil omfatte detaljerede oplysninger om følgende punkter: køn, alder, klinisk historie, comorbiditet, fysisk undersøgelse, blodcelletal, fuldstændige blodanalyser for lever- og nyrefunktion, koagulation, serologiske tumormarkører, tumorplacering og -stadium, tumormasse, metastaser.

LC, CRC og BC CSC'er identifikation Isolering og karakterisering af CSC'er vil blive foretaget ud fra prøver af tumorvæv opnået fra patienter med LC, CRC og BC. Tumorvæv vil blive indsamlet før studiestart, dvs. væv opnået under en diagnostisk eller terapeutisk procedure, såsom kirurgi eller biopsier med andre formål end protokollen. De kirurgiske prøver, der indsamles, vil blive klassificeret i henhold til tumorens specifikke histologiske karakteristika. Fra hver prøve, ved hjælp af enzymatiske og mekaniske procedurer, vil CSC'erne blive opnået og derefter dyrket i passende dyrkningsmedier til efterfølgende at blive brugt til biokemiske og molekylære undersøgelser. Hver prøve vil blive forbundet med patienthistorien på det kirurgiske tidspunkt og et passende opfølgningsprogram bestående af periodiske kliniske og instrumentelle kontroller, der for at tildele en prognostisk værdi til CSC'ernes biologiske karakteristika. Stamceller afledt af de udvalgte epiteltumorer vil derefter gennemgå analyse af overflade- og intracellulære markører for at give en endelig karakterisering af cellulær fænotype. Stamceller afledt af lungekræft, CRC og BC identificeres som en undergruppe af tumorceller, der er positive for markøren CD133.

Tumorprøver vaskes flere gange og efterlades natten over i DMEM:F12-medium suppleret med høje doser af Penicillin/Streptomycin og Fungizon for at undgå kontaminering. Vævsdissociation vil blive udført ved enzymatisk fordøjelse og genvundne celler dyrket i serumfrit medium indeholdende 25 mikrog/ml insulin, 100 mikrog/ml apo-transferrin, 10 mikrog/ml putrescin, 0,03 mM natriumselenit, 20nM progesteron, 06% glucose. 5 mM hepes, 0,1 % natriumbicarbonat, 0,4 % BSA, glutamin og antibiotika, opløst i DMEM-F12-medium og suppleret med 20 ng/ml EGF og 10 ng/ml bFGF. Flasker, der ikke er behandlet til vævskultur, vil blive brugt for at reducere celleadhærens og favoritvækst af udifferentierede tumorkugler. Disse dyrkningsbetingelser selekterer for umodne tumorceller, mens ikke-maligne eller differentierede celler selekteres negativt som vurderet for CSC'er af forskellig oprindelse. Overlevende umodne tumorceller prolifererer langsomt, hvilket giver anledning til tumorcelleaggregater, "sfærer", inden for 1-2 måneder under disse dyrkningsbetingelser. Kugledannende celler kan udvides ved mekanisk dissociation af kugler, efterfulgt af genudpladning af enkeltceller og resterende småcelleaggregater i komplet frisk medium.

Differentiering af LC-, CRC- og BC-kugledannende celler vil blive opnået ved cellekultur i specifikt medium (Cambrex). Fænotype af LC-, CRC- og BC-sfærer og deres differentierede afkom vil blive analyseret ved flowcytometrisk analyse eller immunfluorescens. Især stamcellemarkører som CD133, CD34 og BCRP1 vil blive analyseret.

Successivt vil kræftsfærer blive analyseret for at definere status for stier involveret i processen med spredning, selvfornyelse og overlevelse. Der vil især blive udført tumorspecifik analyse for at undersøge aktiviteten og den mulige ændring af de veje, der er ansvarlige for stamcellehomeostase og global analyse (phosphoproteomic og signaltransduktionsanalyse, innovativ lægemiddeltestning, analyse af processer metastatisering in vivo) med det formål at tilvejebringe et samlet billede af aktiveringstilstanden af ​​de centrale cellulære veje.

Præklinisk model Ved at bruge cancersfærer vil efterforskerne generere ortotopiske xenograft-modeller, der rekapitulerer forældrenes tumoradfærd, herunder de aggressive træk og potentialet for invasivitet. Ortotopisk injektionsteknik vil blive vurderet i 5 uger gamle NOD/SCID-mus. Injektionsproceduren vil blive udført med støtte fra et dissektionsmikroskop. Efter bedøvelse vil 200 til 500 cancersfæreceller, modificeret til at udtrykke et bioluminescerende protein såsom luciferase, blive injiceret ved hjælp af en Hamilton-sprøjte og 32-gauge nål. Metastatiske og lokale tumorer vil blive sammenlignet for deres stamcelleindhold gennem fænotypisk analyse såsom væksthastighed eller andre stamcelleegenskaber, herunder klonogen kapacitet i blød agar eller gennem begrænsende fortyndingsassays. Infektion af CSC'er med lentiviral vektor, der koder for grøn fluorescerende (GFP), samt luciferase reporterproteiner, vil tillade CSC'er sporing in vivo. Især vil den amfotropiske pakkecellelinje 293T blive transficeret ved hjælp af calcium-phosphat/chloroquin-metoden. Kultursupernatanter indeholdende virale partikler vil blive opsamlet efter 48 timers transfektion. Infektion vil blive udført ved at dyrke målceller i 0,45 mikrom filtreret viral supernatant i 3 timer i en CO2-inkubator. To infektionscyklusser vil blive udført for at inficere celler. Mikroskopisk evaluering af GFP-ekspression i viral pakning og målceller vil blive udført ved direkte observation af celler ved hjælp af et omvendt fluorescensmikroskop udstyret med et FITC-filter. Efter infektion vil celler transduceret med luciferase blive sorteret ved flowcytometri for at opnå en ren markeret population. Den lokale tumor og udviklingen af ​​invasivitet vil blive overvåget gennem helkropsbilleddannelsesteknikker, som vil tillade at detektere, lokalisere og kvantificere dynamisk det optiske signal - bioluminescens - i en ikke-invasiv lokalisering af den markerede cellepopulation. Denne procedure vil blive udført ved hjælp af Photon imager in vivo billeddannelsessystem (Biospace Lab), assisteret af den nyeste software til erhvervelse og billedanalyse. Takket være dette system, blev det for nylig erhvervet i laboratoriet og karakteriseret ved en meget høj følsomhed og 20 ms tidsmæssig opløsning, efterforskerne vil analysere ikke-bedøvede og frit bevægende dyr. Bioluminescenssignalet vil blive erhvervet samtidigt som en standardvideo af dyret. Når efterforskerne er sikre på succesen med tumorvækst, vil mus blive ofret. Tumor vil blive fjernet til morfologisk karakterisering og phosphoproteomisk analyse. Sidstnævnte vil blive udført gennem omvendt fase proteinmikroarray, som gør det muligt at opnå en høj grad af følsomhed, præcision og linearitet, hvilket gør det muligt at kvantificere den fosforylerede status af signalproteiner i umodne og differentierede lungekræftceller. Dette system vil give information om specifikke molekylære veje involveret i LC, CRC og BC cellevækst og spredning.

Tumorfølsomhed over for antitumormidler For selektivt at skelne de effektive terapeutiske forbindelser mod de formodede tumor- og invasionsinitierende celler, vil efterforskerne måle levedygtigheden af ​​klonogen LC, CRC og BC efter eksponering for adskillige antitumorlægemidler differentielt kombineret på enkelt tidspunkt punkt op til 96 timer.