Machbarkeitsstudie zum Sensitivitätstest für Stammzellen (STELLA)

Patienten Patienten mit LC, CRC und BC mit gutem Leistungsstatus und verfügbarem Tumorgewebe, bei Versagen konventioneller Therapien oder ohne Möglichkeit, mit einer Therapie mit nachgewiesener Wirksamkeit behandelt zu werden, werden in die Studie aufgenommen. Die anfängliche Charakterisierung des Patienten umfasst detaillierte Informationen zu folgenden Punkten: Geschlecht, Alter, Krankengeschichte, Komorbidität, körperliche Untersuchung, Blutbild, vollständige Blutanalysen für Leber- und Nierenfunktion, Gerinnung, serologische Tumormarker, Tumorlokalisation und -stadium, Tumormasse, Metastasen.

Identifizierung von LC-, CRC- und BC-CSCs Die Isolierung und Charakterisierung von CSCs erfolgt ausgehend von Tumorgewebeproben von Patienten mit LC, CRC und BC. Tumorgewebe wird vor Studieneintritt entnommen, d. h. Gewebe, das während eines diagnostischen oder therapeutischen Verfahrens wie Operationen oder Biopsien mit anderen Zwecken als dem Protokoll gewonnen wird. Die entnommenen chirurgischen Proben werden nach den spezifischen histologischen Merkmalen des Tumors klassifiziert. Aus jeder Probe werden mittels enzymatischer und mechanischer Verfahren die CSCs gewonnen und dann in geeigneten Kulturmedien kultiviert, um anschließend für biochemische und molekulare Studien verwendet zu werden. Jede Probe wird mit der Anamnese des Patienten zum Zeitpunkt der Operation und einem geeigneten Nachsorgeprogramm verbunden, das aus regelmäßigen klinischen und instrumentellen Kontrollen besteht, um den biologischen Eigenschaften der CSCs einen prognostischen Wert zuzuordnen. Stammzellen, die von den ausgewählten epithelialen Tumoren stammen, werden dann einer Analyse von Oberflächen- und intrazellulären Markern unterzogen, um eine endgültige Charakterisierung des zellulären Phänotyps bereitzustellen. Stammzellen aus Lungenkrebs, CRC und BC werden als eine Untergruppe von Tumorzellen identifiziert, die für den Marker CD133 positiv sind.

Tumorproben werden mehrmals gewaschen und über Nacht in DMEM:F12-Medium belassen, das mit hohen Dosen von Penicillin/Streptomycin und Fungizon ergänzt ist, um eine Kontamination zu vermeiden. Die Gewebedissoziation wird durch enzymatischen Verdau durchgeführt und gewonnene Zellen werden in serumfreiem Medium kultiviert, das 25 Mikrogramm/ml Insulin, 100 Mikrogramm/ml Apo-Transferrin, 10 Mikrogramm/ml Putrescin, 0,03 mM Natriumselenit, 20 nM Progesteron, 0,6 % Glucose enthält B. 5 mM Hepes, 0,1 % Natriumbicarbonat, 0,4 % BSA, Glutamin und Antibiotika, gelöst in DMEM-F12-Medium und ergänzt mit 20 ng/ml EGF und 10 ng/ml bFGF. Unbehandelte Flaschen für die Gewebekultur werden verwendet, um die Zellanhaftung und das bevorzugte Wachstum von undifferenzierten Tumorkugeln zu verringern. Diese Kulturbedingungen selektieren für unreife Tumorzellen, während nicht maligne oder differenzierte Zellen negativ selektiert werden, wenn sie auf CSCs unterschiedlichen Ursprungs beurteilt werden. Überlebende unreife Tumorzellen proliferieren langsam, was unter diesen Kulturbedingungen innerhalb von 1-2 Monaten zu Tumorzellaggregaten, "Kugeln", führt. Kugelbildende Zellen können durch mechanische Dissoziation von Kugeln expandiert werden, gefolgt von einer erneuten Ausplattierung einzelner Zellen und kleiner Zellaggregate in vollständig frischem Medium.

Die Differenzierung von kugelbildenden LC-, CRC- und BC-Zellen wird durch Zellkultur in spezifischem Medium (Cambrex) erreicht. Der Phänotyp von LC-, CRC- und BC-Sphären und ihre differenzierten Nachkommen werden durch durchflusszytometrische Analyse oder Immunfluoreszenz analysiert. Insbesondere werden Stammzellmarker wie CD133, CD34 und BCRP1 analysiert.

Anschließend werden Krebssphären analysiert, um den Status der Signalwege zu definieren, die am Prozess der Proliferation, Selbsterneuerung und des Überlebens beteiligt sind. Insbesondere werden tumorspezifische Analysen durchgeführt, um die Aktivität und die mögliche Veränderung von Signalwegen zu untersuchen, die für die Stammzellhomöostase verantwortlich sind, und globale Analysen (Phosphoproteomik- und Signaltransduktionsanalyse, innovative Arzneimitteltests, Analyse von Metastasierungsprozessen in vivo) sollen bereitgestellt werden ein Gesamtbild des Aktivierungszustands der wichtigsten zellulären Signalwege.

Präklinisches Modell Unter Verwendung von Krebskugeln werden die Forscher orthotope Xenograft-Modelle erstellen, die das elterliche Tumorverhalten rekapitulieren, einschließlich der aggressiven Merkmale und des Invasivitätspotenzials. Die orthotope Injektionstechnik wird bei 5 Wochen alten NOD/SCID-Mäusen untersucht. Der Injektionsvorgang wird mit Unterstützung eines Präpariermikroskops durchgeführt. Nach der Betäubung werden 200 bis 500 Krebskugelzellen, die so modifiziert wurden, dass sie ein biolumineszierendes Protein wie Luciferase exprimieren, mit einer Hamilton-Spritze und einer 32-Gauge-Nadel injiziert. Metastasierende und lokale Tumore werden auf ihren Stammzellgehalt durch phänotypische Analyse wie Wachstumsrate oder andere Stammzelleigenschaften einschließlich der klonogenen Kapazität in Weichagar oder durch limitierende Verdünnungsassays verglichen. Die Infektion von CSCs mit einem lentiviralen Vektor, der für grün fluoreszierendes (GFP) kodiert, sowie mit Luciferase-Reporterproteinen wird die Verfolgung von CSCs in vivo ermöglichen. Insbesondere wird die amphotrope Verpackungszelllinie 293T durch das Calciumphosphat/Chloroquin-Verfahren transfiziert. Kulturüberstände, die virale Partikel enthalten, werden nach 48 h Transfektion gesammelt. Die Infektion wird durchgeführt, indem die Zielzellen in einem 0,45 Mikrometer gefilterten Virusüberstand für 3 Stunden in einem CO2-Inkubator kultiviert werden. Es werden zwei Infektionszyklen durchgeführt, um Zellen zu infizieren. Die mikroskopische Bewertung der GFP-Expression in viralen Verpackungen und Zielzellen wird durch direkte Beobachtung der Zellen unter Verwendung eines mit einem FITC-Filter ausgestatteten Umkehrfluoreszenzmikroskops durchgeführt. Nach der Infektion werden mit Luciferase transduzierte Zellen durch Durchflusszytometrie sortiert, um eine reine markierte Population zu erhalten. Der lokale Tumor und die Entwicklung der Invasivität werden durch Ganzkörper-Bildgebungsverfahren überwacht, die es ermöglichen, das optische Signal - Biolumineszenz - in einer nicht-invasiven Lokalisierung der markierten Zellpopulation zu erkennen, zu lokalisieren und dynamisch zu quantifizieren. Dieses Verfahren wird unter Verwendung des Photon-Imager-In-vivo-Bildgebungssystems (Biospace Lab) durchgeführt, unterstützt durch die neueste Software für Akquisition und Bildanalyse. Dank dieses kürzlich im Labor erworbenen Systems, das sich durch eine sehr hohe Empfindlichkeit und eine zeitliche Auflösung von 20 ms auszeichnet, werden die Forscher nicht betäubte und sich frei bewegende Tiere analysieren. Das Biolumineszenzsignal wird gleichzeitig als Standardvideo des Tieres aufgenommen. Sobald die Forscher sicher sind, dass der Tumor wächst, werden die Mäuse getötet. Der Tumor wird zur morphologischen Charakterisierung und phosphoproteomischen Analyse entfernt. Letzteres wird durch einen Reverse-Phase-Protein-Mikroarray durchgeführt, der ein hohes Maß an Empfindlichkeit, Präzision und Linearität ermöglicht und es ermöglicht, den phosphorylierten Status von Signalproteinen in unreifen und differenzierten Lungenkrebszellen zu quantifizieren. Dieses System wird Informationen über spezifische molekulare Wege liefern, die am Wachstum und der Ausbreitung von LC-, CRC- und BC-Zellen beteiligt sind.

Tumorsensitivität gegenüber Antitumormitteln Um die wirksamen therapeutischen Verbindungen selektiv von den mutmaßlichen Tumor- und Invasions-initiierenden Zellen zu unterscheiden, werden die Forscher die Lebensfähigkeit von klonogenen LC, CRC und BC nach der Exposition gegenüber mehreren Antitumor-Medikamenten messen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt unterschiedlich kombiniert wurden Punkt bis zu 96 Stunden.