Haalbaarheidsstudie over stamcelgevoeligheidstest (STELLA)

Patiënten Patiënten met LC, CRC en BC met een goede prestatiestatus en met tumorweefsel beschikbaar, bij wie conventionele therapieën hebben gefaald of die niet kunnen worden behandeld met therapie met bewezen doeltreffendheid, zullen in de studie worden opgenomen. De initiële karakterisering van de patiënt omvat gedetailleerde informatie over de volgende items: geslacht, leeftijd, klinische geschiedenis, comorbiditeit, lichamelijk onderzoek, bloedceltellingen, volledige bloedanalyses voor lever- en nierfunctie, stolling, serologische tumormarkers, tumorlocatie en -stadium, tumormassa, metastasen.

Identificatie van LC, CRC en BC CSC's Isolatie en karakterisatie van CSC's zal gebeuren uitgaande van monsters van tumorweefsel verkregen van patiënten met LC, CRC en BC. Tumorweefsel zal worden verzameld vóór aanvang van het onderzoek, d.w.z. weefsel verkregen tijdens een diagnostische of therapeutische procedure, zoals chirurgie of biopsieën met andere doeleinden dan het protocol. De verzamelde chirurgische monsters zullen worden geclassificeerd volgens de specifieke histologische kenmerken van de tumor. Van elk monster zullen, door middel van enzymatische en mechanische procedures, de CSC's worden verkregen en vervolgens worden gekweekt in geschikte kweekmedia om vervolgens te worden gebruikt voor biochemische en moleculaire studies. Elk monster zal worden geassocieerd met de geschiedenis van de patiënt ten tijde van de operatie en een geschikt follow-upprogramma dat bestaat uit periodieke klinische en instrumentele controles om een ​​prognostische waarde toe te kennen aan de biologische kenmerken van de CSC's. Stamcellen die zijn afgeleid van de geselecteerde epitheliale tumoren zullen vervolgens een analyse van oppervlakte- en intracellulaire markers ondergaan om een ​​definitieve karakterisering van het cellulaire fenotype te geven. Stamcellen afkomstig van longkanker, CRC en BC worden geïdentificeerd als een subset van tumorcellen die positief zijn voor de marker CD133.

Tumorspecimens worden meerdere keren gewassen en een nacht bewaard in DMEM:F12-medium aangevuld met hoge doses penicilline/streptomycine en fungizone om besmetting te voorkomen. Weefseldissociatie zal worden uitgevoerd door enzymatische digestie en teruggewonnen cellen worden gekweekt in serumvrij medium met 25 microgram/ml insuline, 100 microgram/ml apotransferrine, 10 microgram/ml putrescine, 0,03 mM natriumseleniet, 20 nM progesteron, 0,6% glucose , 5 mM hepes, 0,1% natriumbicarbonaat, 0,4% BSA, glutamine en antibiotica, opgelost in DMEM-F12-medium en aangevuld met 20 ng/ml EGF en 10 ng/ml bFGF. Er zullen onbehandelde kolven voor weefselkweek worden gebruikt om celadhesie en favoriete groei van ongedifferentieerde tumorbolletjes te verminderen. Deze kweekomstandigheden selecteren op onrijpe tumorcellen, terwijl niet-kwaadaardige of gedifferentieerde cellen negatief worden geselecteerd zoals beoordeeld op CSC's van verschillende oorsprong. Overlevende onrijpe tumorcellen prolifereren langzaam en geven aanleiding tot tumorcelaggregaten, "bolletjes", binnen 1-2 maanden onder deze kweekomstandigheden. Bolvormende cellen kunnen worden uitgebreid door mechanische dissociatie van bollen, gevolgd door het opnieuw uitplaten van enkele cellen en resterende kleine celaggregaten in volledig vers medium.

Differentiatie van LC, CRC en BC bolvormende cellen zal bekomen worden door celkweek in specifiek medium (Cambrex). Het fenotype van LC-, CRC- en BC-bolletjes en hun gedifferentieerde nakomelingen zullen worden geanalyseerd door middel van flowcytometrische analyse of immunofluorescentie. In het bijzonder zullen stamcelmarkers zoals CD133, CD34 en BCRP1 geanalyseerd worden.

Achtereenvolgens zullen kankersferen worden geanalyseerd om de status te bepalen van paden die betrokken zijn bij het proces van proliferatie, zelfvernieuwing en overleving. In het bijzonder zal tumorspecifieke analyse worden uitgevoerd om de activiteit en de mogelijke verandering van routes die verantwoordelijk zijn voor stamcelhomeostase te onderzoeken en globale analyse (fosfoproteomische en signaaltransductieanalyse, innovatieve geneesmiddelentesten, analyse van processen metastatisatie in vivo) gericht op verschaffen een algemeen beeld van de activeringsstatus van de belangrijkste cellulaire routes.

Preklinisch model Door gebruik te maken van kankerbolletjes zullen de onderzoekers orthotope xenotransplantaatmodellen genereren die het gedrag van de ouderlijke tumor recapituleren, inclusief de agressieve kenmerken en het invasiviteitspotentieel. Orthotopische injectietechniek zal worden beoordeeld in NOD/SCID-muizen van 5 weken oud. De injectieprocedure wordt uitgevoerd met behulp van een ontleedmicroscoop. Na verdoving zullen 200 tot 500 kankerbolcellen, gemodificeerd om een ​​bioluminescent eiwit zoals luciferase tot expressie te brengen, worden geïnjecteerd met behulp van een Hamilton-spuit en een 32-gauge naald. Uitgezaaide en lokale tumoren zullen worden vergeleken op basis van hun stamcelgehalte door middel van fenotypische analyse zoals groeisnelheid, of andere stamceleigenschappen, waaronder klonogene capaciteit in zachte agar of door beperkende verdunningstesten. Infectie van CSC's met lentivirale vector, coderend voor groen fluorescerend (GFP), evenals luciferase-reportereiwitten, zal CSC's in vivo kunnen volgen. In het bijzonder zal de amfotrope verpakkingscellijn 293T worden getransfecteerd met de calciumfosfaat/chloroquine-methode. Kweeksupernatanten die virale deeltjes bevatten, zullen na 48 uur transfectie worden verzameld. Infectie zal worden uitgevoerd door het kweken van doelcellen in 0,45 micrometer gefilterd viraal supernatant gedurende 3 uur in een CO2-incubator. Er zullen twee infectiecycli worden uitgevoerd om cellen te infecteren. Microscopische evaluatie van GFP-expressie in virale verpakking en doelcellen zal worden uitgevoerd door directe observatie van cellen met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop uitgerust met een FITC-filter. Na infectie zullen cellen getransduceerd met luciferase worden gesorteerd door middel van flowcytometrie om een ​​zuiver gemarkeerde populatie te verkrijgen. De lokale tumor en de ontwikkeling van de invasiviteit zullen gevolgd worden door middel van beeldvormingstechnieken van het hele lichaam, die het mogelijk zullen maken om het optische signaal - bioluminescentie - dynamisch te detecteren, lokaliseren en kwantificeren in een niet-invasieve lokalisatie van de gemarkeerde celpopulatie. Deze procedure zal worden uitgevoerd met behulp van het Photon imager in vivo beeldvormingssysteem (Biospace Lab), bijgestaan ​​door de meest recente software voor acquisitie en beeldanalyse. Dankzij dit systeem, dat onlangs in het laboratorium is verkregen en wordt gekenmerkt door een zeer hoge gevoeligheid en een temporele resolutie van 20 ms, kunnen de onderzoekers niet-verdoofde en vrij bewegende dieren analyseren. Het bioluminescentiesignaal wordt gelijktijdig verkregen als een standaardvideo van het dier. Zodra de onderzoekers zeker zijn van het succes van de tumorgroei, zullen muizen worden opgeofferd. Tumor zal worden verwijderd voor morfologische karakterisering en fosfoproteomische analyse. Dit laatste zal worden uitgevoerd door middel van reverse phase protein microarray, waarmee een hoge mate van gevoeligheid, precisie en lineariteit kan worden bereikt, waardoor het mogelijk wordt om de gefosforyleerde status van signaaleiwitten in onrijpe en gedifferentieerde longkankercellen te kwantificeren. Dit systeem zal informatie verschaffen over specifieke moleculaire routes die betrokken zijn bij de groei en verspreiding van LC-, CRC- en BC-cellen.

Tumorgevoeligheid voor antitumormiddelen Om selectief de effectieve therapeutische verbindingen te onderscheiden van de vermoedelijke tumor en invasie-initiërende cellen, zullen de onderzoekers de levensvatbaarheid van klonogene LC, CRC en BC meten na blootstelling aan verschillende antitumorgeneesmiddelen die differentieel zijn gecombineerd op een enkelvoudig tijdstip punt tot 96 uur.