肝切除後の肝臓再生のメディエーターに関する研究

肝切除後の肝再生（PHLR）のメディエーターの発現を研究し、非肝切除群と比較する前向き非ランダム化試験：パイロット研究

背景 : 肝切除後の動物モデルを用いた実験的研究は、肝再生のメカニズムを研究するために使用されてきました。 さまざまな疾患に対する肝切除および生体肝移植は、生体内での肝再生メカニズムを研究するための優れたヒトモデルを提供します。 これらの研究は、動物実験によって得られた知識の臨床応用に必要であり、肝不全、肝硬変、および癌の管理のための新しいモダリティを開発するためのさらなる研究を導きます。

序章 ：

肝臓は、生命の維持に必要なさまざまな代謝および保護機能を提供する重要な臓器であり、部分切除後に再生および体積を回復する固有の可能性を持っています。 肝切除後の肝再生は、主に成熟肝細胞の増殖によって起こる (Fausto N 2003 & 2004)。門脈血行動態とサイトカイン (IL-6、TNF-α) の変化は、このプロセスの最も重要なトリガー要因と考えられています。 (Abhshagen K et al 2012, Scotte M et al 1997) 残肝への門脈血の送達が増加すると、再生カスケードを活性化する NO や VEGF などの因子の放出につながるせん断応力障害が生じることが提案されています (Marabushi et al 2004)。 サイトカイン (IL-6 および TNF-α)、NO および VEGF はプロ HGF (不活性肝細胞増殖因子) に作用して活性 HGF に変換し、Met 受容体を介して作用して、初期段階の重要なメディエーターである STAT-3 をさらに活性化します。 PHLR。 (Abhshgen K et al 2008,Cresman DE et al 1996, Cressman DE1997, Sudo K et al 2008, Borowicak M et al 2004, Paranjpe S et al 2007) 残肝への門脈血の送達が増加すると、単位当たりのアミノ酸利用率も増加する、膵臓ホルモン、腸由来のエンドトキシン、およびその他の肝栄養因子など、これらすべてが DNA 複製を活性化するために直接作用する可能性があります。 (Bucher NL et al 1977, Riehle KJ et al 2011) 無傷のラットにアミノ酸混合物を投与すると、肝細胞複製の波が誘導され、その欠乏により PHLR がブロックされます。 (Mead JE et al 1990) インスリン、グルカゴン、成長ホルモンも肝臓の再生に大きな影響を与えます。 (Bucher NLR 1976, Shi min luo et al 2004, Amal ZS et al 2011 ) 部分切除後の肝臓の再生能力により、生体肝移植、肝腫瘍、胆道癌の肝切除を行うことができます。 これらの条件の肝切除は、人間の肝臓再生の in vivo メカニズムを研究するための良いモデルも提供します。 これらの研究は、肝切除後の動物に関する実験的研究によって得られた知識の臨床応用にとって重要です。 これらの研究は、肝切除後の肝再生（PHLR）のさまざまな段階のメディエーターを知るのに役立ち、「サイズが小さい症候群」、肝不全などの生命を脅かす肝切除後の合併症の予防と管理のための新しいアプローチを開発するための将来の研究を導きます. これらのトレイルは、細胞増殖の in vivo 制御を理解するのに役立ち、肝硬変や癌を治療するための新しい治療アプローチを開発するために不可欠であることが証明される可能性があります。

帰無仮説: 肝切除後肝再生 (PHLR) のメディエーターの発現は、肝切除 (研究グループ) と非肝切除グループ (対照グループ) の間で違いはありません。

目的: 肝切除後の肝再生 (PHLR) のメカニズムを研究し、肝切除 (研究グループ) と非肝切除グループ (対照グループ) の間で PHLR のメディエーターの発現を比較すること。

目的 :

1. ヒトモデルでPHLRのメディエーターを研究する。
2. 肝切除（研究群）と非肝切除（対照群）の間でメディエーターPHLRの発現を比較する。
3. 肝臓組織におけるPHLRの初期変化を研究する。 患者と方法：この非無作為化試験は、患者の2つのグループ（肝切除（研究）グループと非肝切除（対照）グループ）で実施され、最低10人の連続した成人（18歳以上）の患者が各グループに募集されます以下に示す包含および除外基準に従って。 インフォームド コンセントは、両方のグループの患者から取得されます。 末梢 (前腕静脈から) 静脈血 (6 ml) は、手術の前日と手術後の 1、3、7、14 (2 週間)、42 (6 週間)、および 180 (6月）。 門脈の小さな枝に、門脈圧の測定と門脈血 (6 ml) の収集のための 20 ゲージの静脈内カテーテルを挿入します。腹部の閉鎖。 末梢静脈（前腕静脈）からの血液サンプルの採取、門脈圧の測定、および門脈血の採取は両方の研究グループで行われますが、肝切除（研究）グループの患者は追加の手順、つまりトルカット（針）を受けます残肝からの生検。

肝生検標本はホルマリン溶液で保存され、PHLR 中の初期変化とその可能性のあるメディエーターを検出するために病理学研究室に移されます。切除標本に存在する正常な肝臓組織は、自己管理として機能します。 末梢静脈および門脈の小枝からの血液は、この目的に使用される標準バイアルに収集され、分析のために実験室に移され、肝臓再生のメディエーターが検出されます。 血液サンプルの分析は、ELISHA法を使用して行われます。 門脈圧の測定は、門脈の小枝のカニューレ挿入によって行われます (例: 胃大網静脈) 静脈内のエントリの後、この静脈内カテーテルは、通常の生理食塩水で満たされた接続チューブを介してデジタル圧力記録計に接続されます。 このデジタル圧力レコーダーは、各麻酔ワークステーション (メーカー: Drager) で利用でき、通常は mm Hg で測定されます。圧力記録は手術の前後に行われ、手術が門脈圧に及ぼす影響を観察します。

包含基準：肝臓の部分切除（研究群）または消化管の他の部分の切除（対照群）のいずれかを必要とする消化管の悪性新生物を有する成人患者（18歳以上）で、研究への参加を希望している。

除外基準 - 研究への参加を望まない患者。 -PHLRのメディエーターの発現に影響を与える可能性のある状態の患者（例： 免疫抑制、慢性肝炎、肝硬変、門脈圧亢進症、妊娠、避妊薬の使用）、手術中に進行性または手術不能な疾患があることが判明した患者は研究から除外され、それらから収集されたデータは分析に含まれません。

サンプルサイズ: 各グループで最低 10 人の患者 デザイン: 非無作為化前向き試験 研究の場所: 消化器外科、GBPH および MAMC、ニューデリー 期間: 2 年。 フォローアップ: 6 か月 資金調達: 研究者は政府機関からの資金調達を申請します。 ELISA 法により末梢血で分析される PHLR のメディエーター - IL-1 IL-6、T N F-α、TNF-β、HGF (肝細胞増殖因子)、GH (成長ホルモン)、インスリン、グルカゴン。

肝生検標本の検査 (免疫組織化学): 有糸分裂指数 (Ki 67)、EPCAM、STAT-3、HGF、VEGF、NKAM、および CD133 の受容体。

統計的方法: すべてのデータは Microsoft Excel に入力され、統計計算は SPSS ソフトウェアを使用して実行されます。 肝切除前後の肝臓組織におけるさまざまな組織因子の発現の平均を比較するために、調査員は、変数の分布が正常である場合は対応のある t 検定を使用し、非正規分布についてはウィルコックス オン符号順位検定を使用する必要があります。 研究グループと対照グループの患者の血清中の肝再生メディエーターの発現を比較するために、研究者は、正規分布については独立した t 検定を、非正規分布についてはマン ホイットニー検定を使用するものとします。 手術前後の異なる時点での肝臓再生のメディエーターの血清レベルの平均値を調べるために、研究者は、正規分布にはANOVAを、非正規分布にはフリードマン検定を使用し、その後に事後検定を使用する必要があります。 0.5 以下の P 値は、有意性を導き出すために使用されます。

文献展望：

肝切除後の肝臓再生は非常に複雑で整然としたプロセスであり、成熟した肝細胞が増殖して肝臓の体積を回復することを含みます。肝臓再生の正確なメカニズムは現在まで明らかにされていませんが、動物研究 (ラット、マウス、イヌなど) に基づく証拠は、門脈血行動態の変化、サイトカイン、成長因子 (HGF、TGF、EGF)、ホルモン (GH、インスリン、アドレナリンなど) は、何百もの遺伝子によって制御されるこのプロセスに積極的に関与しています。 (Fausto N 2012 and Michelopoulos 2010) Marabushi et al (2004) は、残肝への門脈血送達量の急激な増加が、一酸化窒素 (NO) の産生、カルシウムチャネルの活性化、および放出につながるせん断応力損傷を引き起こすと提案しました。 VEGF;それらはすべて、再生プロセスの開始において重要な役割を果たします。 Bucher NL (1964) は、門脈血流の血行力学的変化が肝切除の範囲に直接関係していることを観察しました。 Sato et al (1997&1999) は、Bucher NL の所見を再確認し、肝臓の再生が進行するにつれて門脈圧が徐々に増加し、その完了に向けて低下することも観察しました。 Wang and Lautt (1998)、Cantre D et al (2008)、Schoen JM et al (2001)、Mei Y et al (2011) などのさまざまな研究者による実験的研究により、肝細胞増殖の原因となる因子の活性化における NO の役割がさらに確認されました。 類洞内皮から放出された VEGF は、せん断応力損傷に対する応答であり、HGF (肝細胞増殖因子) を刺激して c-met 受容体に作用し、肝細胞の増殖を開始します。 (Paranjpe S et al 2007,Borowiak M et al 2004) 肝硬変に関連する門脈圧亢進症は、類洞内皮細胞 (SEC) の毛細血管形成およびふるい板の損失によるせん断応力関連の損傷にはつながりません。 (Sato et al 1997 & Vollmer et al 1998)。

Suenaga M (1983) は、イヌの部分肝切除後の肝再生における門脈血の役割を研究し、肝再生には十分な量の門脈血が必要であり、門脈血中の高濃度のアミノ酸が再生プロセスにプラスの影響を与えることに気付きました。 別の研究で、Skov OP et al (1988) は、門脈血が多量の EGF (表皮成長因子)、膵臓ホルモン (インスリン、グルカゴン)、および肝臓の再生に積極的に関与する他の成長因子を含むことを指摘しました。 Bucher NL (1976 年と 1977 年) は、インスリンとグルカゴンの両方が肝切除後の肝臓の再生と DNA 合成を促進することを観察しましたが、どちらも無傷の肝臓で肝細胞の増殖を誘発することはできませんでした。肝切除および内臓摘出ラットにおいて。 これらの 2 つ (インスリンとグルカゴン) に加えて、成長ホルモン、Nor アドレナリン、セロトニンなどの他のホルモンもこのプロセスに関与しています。 ( Amal ZS et al, 2011; Shi Min Luo, 2004) IL-6 と TNF-α は PHLR の開始に不可欠な 2 つの因子であり、門脈血にはリポ多糖、補体因子、細胞間接着分子などの腸由来因子が含まれています。クッパー細胞を活性化して IL-6 と TNF-α を放出し、パラクリン的に作用して再生を開始します。 N 2006、Michelopoulos 2007、Cressman DE et al 1996、Feingold KR et al 1988、Sudo K et al 2008、Yamada Y et al 1997、Cornell RP et al 1985)。 Il-6、TNF-α、VEGF、NO は、強力な肝細胞マイトジェンである HGF (肝細胞増殖因子) を活性化することによって再生を開始します。 (Diaz JJ et al 2011、Cantre D et al 2008、Rai RM et al 2005)。 HGF は、上皮成長因子 (EGF)、線維芽細胞成長因子 (FGF)、トランスフォーミング成長因子 (TGF)、肝栄養ホルモン、および他のいくつかの既知および未知の因子とともに、肝細胞の増殖と増殖を制御します。 (Fausto N 1993、Fausto N および Mead JE 1989)。HGF は肝細胞の Met 受容体に結合し、肝細胞の成長と増殖を活性化します。(ボロウィック) et al 2004) HGF、EGF、および TGF アルファは、他の因子がなくても正常な肝臓で肝細胞の増殖を誘導できるため、強力な in vitro マイトジェンであり、サイトカインなどの因子の存在下では、かなりの割合の肝細胞の増殖を刺激することができます。 (Block GD et al 1996,Webber EM et al 1998) TGF-α は、ラット肝細胞培養に添加すると、DNA 合成と c-myc 発現を誘導することができます。 (Skouteris GG and Menamin MM 1992) プロスタグランジン (PGE-2) のような炎症性メディエーターも、ラットの肝切除後にレベルが上昇するため、肝臓の再生に何らかの役割を果たします。このプロセスは c-AMP に依存しています。プロスタグランジンを肝細胞培養に添加すると、DNA 合成が増加することがわかっています。 (Tsujii H et al, 1993) EGF は初代培養ラットの新生児肝細胞を刺激して S 期と M 期に入り、4 時間という早い時期に検出でき、その後 12 ～ 16 時間でピークに達します。血清因子とグルカゴンとインスリンの投与により、さらに成長が増幅されます。 (Draghi E et al, 1980) HGF は PHLR で重要な役割を果たし、met 受容体に結合した後、初期応答遺伝子の誘導を仲介する STAT-3 (シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子 3) を活性化し、Met 変異マウスは肝再生障害を示しています。 .( Borowiak M et al 2004) Huh CG et al は、2004 年に Met 変異マウスに関する研究により、HGF/C-Met シグナル伝達経路が発生、肝臓再生、および腫瘍形成において中心的な役割を果たすことを示しました。 HGF/Met 経路は、肝部分切除後 24 時間の細胞周期を促進し、アポトーシスを阻害するために、p53、サイクリン E、およびサイクリン B を含む、細胞周期およびアポトーシスに関連する多くの遺伝子の発現を調節します。 ( Paranjpe S et al 2007) STAT-3 (シグナルトランスデューサーおよびアクティベーター-3) は、肝切除後のさまざまな一次成長応答遺伝子を調節する転写因子であり、さまざまな成長因子およびサイトカインによって活性化されます。(Li W et al 2002) STAT -3 DNA 結合活性は、PH (部分肝切除) の 30 分以内に残存肝臓で増加し、3 時間以内に 30 倍にピークに達し、この増加は偽手術後には発生しません。 (Cressman DE et al, 1995) いくつかの癌原遺伝子も肝臓再生の開始と完了に関与しており、これらの c-fos のうち、c-jun と c-myc が重要な遺伝子です。 C-fos および c-jun 転写レベルは、肝切除のほぼ直後に肝臓で増加し、2 時間までに正常に戻ります。 これに続いて、c-myc m RNAが上昇し、2時間でピークに達し、4時間で基底レベルに低下します。 (Fausto N et al 1989; Morello D, 1989) さらなる研究で、Morello D et al (1990) は、肝切除後の c-myc RNA の増加が偽手術後の増加より何倍も高いことを発見しました。

上記の要因に加えて、卵円細胞、マクロファージ、血小板、幹細胞 (CD133+) などのいくつかの細胞も直接的または間接的に PHLR に関与しています。 RP et al 1987、Nakamura T et al 1986、Fausto N 2004、Xiang S et al 2012) amEsch JS (2012) による研究では、CD 133+ 幹細胞の注入により、肝予備能および拡張肝切除後の全体的な転帰が改善されました。 T細胞は肝臓の再生にも影響を与える可能性があり、T細胞とリンホトキシンが欠損したマウスは肝臓の再生能力が低下しています。 ( Anders SA et al 2005, Tumanov AV et al 2009) 卵形細胞は TGF-β による阻害の感受性が低く、成熟肝細胞の増殖を著しく阻害できるため、これらの細胞 (卵形細胞) は肝臓再生の代替経路を提供します。 (Lenanh NN et al 2007) TGF ベータは無制御の肝細胞増殖の阻害剤であり、TGF ベータ m RNA 発現は細胞分裂と有糸分裂の完了に向かってピークに達し、EGF 活性にも阻害効果があります。 (Nquyen LN et al 2007、Braun L et al、1988、Fausto N et al 1990)。 Romero GJ et (2005) による研究では、TGF ベータ受容体ノックアウト肝切除マウスは、肝細胞増殖の増加と肝臓質量対体比の増加を示しました。

Scotte M et al (1997) は、ラットのマイナーおよびメジャー肝切除後の肝臓におけるサイトカイン発現を研究し、マイナーおよびメジャー肝切除後に TNF および IL-1 が増加する一方で、IL-6 アップレギュレーションはメジャー (80%) 肝切除後により顕著であることを発見しました。 Li J et al (2009) は、ラットの主要 (2/3) およびマイナー (1/3) 肝切除後の再生プロファイルを比較し、肝切除後 4、12、および 30 時間の遺伝子発現プロファイルは、いくつかの遺伝子にもかかわらず、同様のアップおよびダウンレギュレーションを示しました。主要な肝切除後に優先的な発現を示しました。 Masson S et al (1999) はまた、ラットの肝再生に対する切除範囲の影響を研究し、肝切除の範囲に関係なく再生反応が起こるが、再生の過程と成長因子の発現は切除された肝臓の体積によって異なると結論付けました。 M Nagino et al (2011) は、肝切除後の最初の 2 週間で肝臓が急速に再生し、その後はゆっくりと進行し、元の肝容積の 3/4 に達すると停止することを観察しました。これは通常、肝切除後 6 か月から 1 年で発生します。 彼らはまた、切除範囲、体表面積、門脈切除、門脈動員、ICG クリアランスなどの要因が、肝切除後の肝容積の再生に関連していることにも気付きました。