간절제술 후 간 재생 매개체에 관한 연구

간절제술 후 간재생(PHLR) 매개인자의 발현을 연구하고 비간절제군과 비교하기 위한 전향적 비무작위 시험: 파일럿 연구

배경 : 간 재생의 기전을 연구하기 위해 간절제술 후 동물모델을 이용한 실험적 연구들이 이용되어 왔다. 다양한 질병에 대한 간 절제술과 생체 기증자 간 이식은 간 재생의 생체 내 메커니즘을 연구하는 데 좋은 인간 모델을 제공합니다. 이러한 연구는 동물 실험에서 얻은 지식을 임상에 적용하는 데 필요하며 간부전, 간경화 및 암 관리를 위한 새로운 방식을 개발하기 위한 추가 연구를 안내할 것입니다.

소개 :

간은 생명 유지에 필요한 다양한 대사 및 보호 기능을 수행하는 필수 기관이며, 부분 절제 후 재생 및 회복의 고유한 잠재력을 가지고 있습니다. 간 절제술 후 간 재생은 주로 성숙한 간세포의 증식에 의해 발생합니다(Fausto N 2003 & 2004). 이 과정에서 가장 중요한 트리거 요인으로 간주되는 포털 혈액양과 사이토카인(IL-6, TNF-α)의 변화입니다. (Abhshagen K et al 2012, Scotte M et al 1997) 남은 간으로의 문맥 혈액 전달 증가는 재생 캐스케이드를 활성화하는 NO 및 VEGF와 같은 인자의 방출로 이어지는 전단 응력 손상을 생성한다고 제안됩니다(Marabushi et al 2004). 사이토카인(IL-6 및 TNF-α), NO 및 VEGF는 pro HGF(비활성 간세포 성장 인자)에 작용하여 이를 Met 수용체를 통해 작용하는 활성 HGF로 전환하여 초기 단계의 핵심 매개체인 STAT-3를 추가로 활성화합니다. PHLR. (Abhshgen K et al 2008, Cresman DE et al 1996, Cressman DE1997, Sudo K et al 2008, Borowicak M et al 2004, Paranjpe S et al 2007) 남은 간으로의 문맥 혈액 전달 증가는 또한 단위당 아미노산 가용성을 증가시킵니다. , 췌장 호르몬, 장 유래 내독소 및 기타 간영양 인자, 이 모든 것들은 DNA 복제를 활성화하기 위해 직접적으로 작용할 수 있습니다. (Bucher NL et al 1977, Riehle KJ et al 2011) 온전한 쥐에게 아미노산 혼합물을 투여하면 간세포 복제의 파동이 유도되고 그 박탈은 PHLR을 차단합니다. (Mead JE et al 1990) 인슐린, 글루카곤 및 성장 호르몬도 간 재생에 중요한 영향을 미칩니다. (Bucher NLR 1976, Shi min luo et al 2004, Amal ZS et al 2011) 부분 절제 후 간의 재생 능력을 통해 생체 기증자 간 이식, 간 종양 및 담도암에 대해 간 절제술을 수행할 수 있습니다. 이러한 조건에 대한 간 절제술은 또한 인간의 간 재생의 생체 내 메커니즘을 연구하는 좋은 모델을 제공합니다. 이러한 연구는 간 절제술 후 동물에 대한 실험적 연구에서 얻은 지식의 임상 적용에 중요합니다. 이러한 연구는 간절제술 후 간 재생(PHLR)의 다양한 단계의 중재자를 파악하는 데 도움이 될 것이며 "크기에 비해 작은 증후군", 간부전과 같은 생명을 위협하는 간절제술 후 합병증의 예방 및 관리를 위한 새로운 접근법을 개발하기 위한 향후 연구를 안내할 것입니다. . 이러한 트레일은 세포 증식의 생체 내 제어를 이해하는 데 도움이 될 것이며 간경화 및 암을 치료하기 위한 새로운 치료법을 개발하는 데 중요할 수 있습니다.

귀무 가설: 간절제술 후 간 재생(PHLR) 매개체의 발현은 간절제술(연구 그룹)과 비간절제술 그룹(대조군) 간에 차이가 없습니다.

목적: 간절제술 후 간재생(PHLR)의 기전을 연구하고 간절제술(연구군)과 비간절제군(대조군) 간의 PHLR 매개인자의 발현을 비교하고자 한다.

목표 :

1. 인간 모델에서 PHLR의 매개체를 연구합니다.
2. 간절제술(연구군)과 비간절제술(대조군) 사이의 중재자 PHLR의 발현을 비교하기 위함.
3. 간 조직에서 PHLR의 초기 변화를 연구합니다. 환자 및 방법: 이 전향적 비무작위 추적은 간절제(연구) 그룹과 비간절제(대조) 그룹의 두 환자 그룹에서 수행되며 각 그룹에서 최소 10명의 연속 성인(18세 이상) 환자를 모집합니다. 아래 주어진 포함 및 제외 기준에 따라. 두 그룹의 환자로부터 사전 동의를 얻습니다. 말초(팔뚝 정맥에서) 정맥혈(6ml)은 수술 하루 전과 수술 후 1일, 3일, 7일, 14일(2주), 42일(6주) 및 180일(6일)에 수집됩니다. 개월). 문맥의 작은 가지에 문맥압 측정을 위한 20게이지 정맥 카테터를 삽입하고 수술 시작 시 문맥혈(6ml)을 채혈합니다. 복부 폐쇄. 말초 정맥(팔뚝 정맥)에서 혈액 샘플 채취, 문맥 압력 측정 및 문맥 혈액 채취는 연구 그룹 모두에서 수행되지만 간절제(연구) 그룹의 환자는 추가 절차 즉, trucut(바늘)을 받게 됩니다. 남은 간에서 생검.

간 생검 표본은 포르말린 용액에 보존되고 PHLR 동안의 초기 변화와 가능한 매개체를 감지하기 위해 병리학 실험실로 옮겨지며, 절제된 표본에 존재하는 정상 간 조직은 자체 제어 역할을 합니다. 말초 정맥 및 간문맥의 작은 가지로부터의 혈액은 이 목적을 위해 사용되는 표준 바이알에 수집되고 간 재생 매개체를 검출하기 위한 분석을 위해 실험실로 옮겨질 것입니다. 혈액 샘플 분석은 ELISHA 방법을 사용하여 수행됩니다. 문맥 압력의 측정은 문맥의 작은 분지(예: Gastro epiploic vein) 정맥 내부로 들어간 후 이 정맥 카테터는 생리 식염수로 채워진 연결 튜브를 통해 디지털 압력 기록기에 연결됩니다. 이 디지털 압력 기록기는 각 마취 워크 스테이션(Make: Drager)에서 사용할 수 있으며 일반적으로 mm Hg로 측정되며, 압력 기록은 수술 전후에 수술이 문맥 압력에 미치는 영향을 관찰하기 위해 수행됩니다.

포함 기준: 간의 부분 절제(연구군) 또는 위장관의 다른 부분 절제(대조군)가 필요한 위장관의 악성 신생물이 있고 연구에 참여할 의향이 있는 성인 환자(18세 이상).

제외 기준 - 연구에 참여할 의향이 없는 환자. PHLR 매개체의 발현에 영향을 미칠 수 있는 상태의 환자(예: 면역 억제, 만성 간염, 간경변, 문맥 고혈압, 임신, 피임 사용), 수술 중 진행성 또는 수술 불가능한 질병이 발견된 환자는 연구에서 제외되며 이들로부터 수집된 데이터는 분석에 포함되지 않습니다.

샘플 크기: 각 그룹에 최소 10명의 환자 디자인: 전향적 비무작위 추적 연구 장소: 소화기 외과, GBPH 및 MAMC, 뉴델리 기간: 2년. 후속 조치: 6개월 자금 지원: 조사관은 정부 기관에 자금 지원을 신청합니다. IL-1 IL-6, TNF-α, TNF-β, HGF(간세포 성장 인자), GH(성장 호르몬), 인슐린 및 글루카곤 등 ELISA 방법으로 말초 혈액에서 분석할 PHLR의 매개체.

간 생검 표본 검사(면역조직화학): 유사분열 지수(Ki 67), EPCAM, STAT-3, HGF, VEGF, NKAM 및 CD133에 대한 수용체.

통계적 방법: 모든 데이터는 Microsoft Excel에 입력되고 통계 계산은 SPSS 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 간절제술 전과 후의 간 조직에서 다양한 조직 인자의 발현 수단을 비교하기 위해 연구자는 변수의 분포가 정규분포이면 paired t test를, 비정규분포이면 Wilcox-on sign rank test를 사용한다. 연구군과 대조군의 환자 혈청에서 간 재생 매개체의 발현을 비교하기 위해 연구자는 정규 분포에 대해 독립 t 검정을 사용하고 비정규 분포에 대해 Mann Whitney 검정을 사용해야 합니다. 수술 전후의 서로 다른 시점에서 간 재생 매개체의 혈청 수준의 평균을 연구하기 위해 연구자는 정규 분포에 ANOVA를 사용하고 비정규 분포에 대해 Friedman 테스트를 사용하고 사후 테스트를 수행해야 합니다. 0.5 이하의 P 값을 사용하여 유의성을 도출합니다.

문헌 검토:

간 절제술 후 간 재생은 간 부피를 회복하기 위해 성숙한 간세포의 증식을 포함하는 매우 복잡하고 규칙적인 과정입니다. 간 재생의 정확한 메커니즘은 지금까지 밝혀지지 않았지만 동물 연구(쥐, 생쥐, 개 등)에 기반한 증거는 급성 포털 혈류역학의 변화, 사이토카인, 성장 인자(HGF,TGF,EGF), 호르몬(GH, 인슐린, 아드레날린과 같은)은 수백 개의 유전자에 의해 제어되는 이 과정에 적극적으로 관여합니다. (Fausto N 2012 및 Michelopoulos 2010) Marabushi 등(2004)은 잔여 간으로의 문맥 혈액 전달량의 급격한 증가가 산화질소(NO) 생성, 칼슘 채널 활성화 및 방출로 이어지는 전단 응력 손상을 생성한다고 제안했습니다. VEGF; 그들 모두는 재생 프로세스를 시작하는 데 중요한 역할을 합니다. Bucher NL(1964)은 간문맥 혈류의 혈역학적 변화가 간절제 범위와 직접적으로 관련이 있으며 90% 간절제 후 문맥압 증가가 70% 간절제 후보다 훨씬 높다는 것을 관찰했습니다. Sato 등(1997&1999)은 Bucher NL의 결과를 재확인했으며 또한 간 재생이 진행됨에 따라 간문맥 압력이 점진적으로 증가하고 완료될 때까지 감소하는 것을 관찰했습니다. Wang 및 Lautt(1998), Cantre D et al(2008,)Schoen JM et al(2001) 및 Mei Y et al(2011)과 같은 다양한 연구자들에 의한 실험적 연구는 간세포 증식을 담당하는 인자의 활성화에서 NO의 역할을 추가로 확인했습니다. 정현파 내피에서 방출된 VEGF는 전단 응력 손상에 대한 반응으로 HGF(간세포 성장 인자)를 자극하여 c-met 수용체에 작용하고 간세포 증식을 개시합니다. (Paranjpe S et al 2007, Borowiak M et al 2004) 간경변증과 관련된 문맥 고혈압은 정현파 내피 세포(SEC)의 모세관 형성 및 체판의 손실로 인해 손상과 관련된 전단 응력으로 이어지지 않습니다. (Sato et al 1997 & Vollmer et al 1998).

Suenaga M(1983)은 개에서 부분 간 절제술 후 간 재생에서 문맥 혈액의 역할을 연구했으며 간 재생에 적절한 양의 문맥 혈액이 필요하고 문맥 혈액의 높은 농도의 아미노산이 재생 과정에 긍정적인 영향을 미친다는 사실을 발견했습니다. 또 다른 연구에서 Skov OP et al(1988)은 간문맥 혈액이 많은 양의 EGF(표피 성장 인자), 췌장 호르몬(인슐린, 글루카곤) 및 간 재생에 적극적으로 참여하는 기타 성장 인자를 함유하고 있다고 언급했습니다. Bucher NL(1976, 1977)은 인슐린과 글루카곤 모두 간절제술 후 간 재생과 DNA 합성을 촉진하지만 정상 간에서는 둘 다 간세포 증식을 유도하지 못하지만 간세포 증식을 유도할 수 있기 때문에 비문구 인자가 필요하다고 밝혔다. hepatectomized 및 eviscerated 쥐에서. 이 두 가지(인슐린 및 글루카곤) 외에도 성장 호르몬, 노르 아드레날린, 세로토닌 등과 같은 다른 호르몬도 이 과정에 참여합니다. (Amal ZS et al, 2011; Shi Min Luo, 2004) IL-6 및 TNF-α는 PHLR의 개시에 필수적인 두 가지 인자이며, 문맥혈은 리포다당류, 보체 인자 및 세포간 부착 분자와 같은 장 유래 인자를 포함합니다. Kupffer 세포를 활성화하여 주변분비 방식으로 작용하여 재생을 시작하는 IL-6 및 TNF-α를 방출합니다.(Fausto N 2006, Michelopoulos 2007, Cressman DE 외 1996, Feingold KR 외 1988, Sudo K 외 2008, Yamada Y 외 1997, Cornell RP 외 1985). Il-6,TNF-α, VEGF, NO는 강력한 간세포 분열 촉진제인 HGF(간세포 성장 인자)를 활성화하여 재생을 시작합니다. (Diaz JJ 외 2011, Cantre D 외 2008, Rai RM 외 2005). HGF는 표피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 형질전환 성장 인자(TGF), 간영양 호르몬 및 기타 여러 알려지거나 알려지지 않은 인자와 함께 간세포 증식 및 증식을 제어합니다. (Fausto N 1993, Fausto N and Mead JE 1989).HGF는 간세포의 Met 수용체에 결합하여 간세포의 성장과 증식을 활성화합니다.(Borowick et al 2004) HGF, EGF 및 TGF alfa는 다른 요인이 없는 경우에도 정상적인 간에서 간세포 증식을 유도할 수 있고 사이토카인과 같은 요인이 있는 경우 상당한 비율의 간세포 증식을 자극할 수 있기 때문에 강력한 체외 미토겐입니다. (Block GD et al 1996, Webber EM et al 1998) TGF-α는 래트 간세포 배양에 첨가될 때 DNA 합성 및 c-myc 발현을 유도할 수 있다. (Skouteris GG 및 Menamin MM 1992) 프로스타글란딘(PGE-2)과 같은 염증성 매개체는 쥐의 간절제술 후 농도가 증가함에 따라 간 재생에 어느 정도 역할을 하며 이 과정은 c-AMP에 의존합니다. 간세포 배양에 프로스타글란딘을 추가하면 o DNA 합성이 증가하는 것으로 밝혀졌습니다. (Tsujii H et al, 1993) EGF는 1차 배양에서 신생 쥐 간세포를 자극하여 S 및 M 단계로 들어갈 수 있으며, 이는 빠르면 4시간에 감지할 수 있고 그 후 12~16시간 사이에 정점에 도달하며 감소하며 이 효과는 조절될 수 있습니다. 혈청 인자와 글루카곤 및 인슐린 투여에 의해 성장이 더욱 증폭됩니다. (Draghi E et al, 1980) HGF는 PHLR에서 중요한 역할을 합니다. met 수용체에 결합한 후 초기 반응 유전자의 유도를 매개하는 STAT-3(signal transducer and activator of transcription 3)를 활성화하고 Met 돌연변이 마우스는 손상된 간 재생을 보였습니다. .( Borowiak M et al 2004) Huh CG et al은 2004년 Met 돌연변이 마우스에 대한 연구에서 HGF/C-Met 신호 전달 경로가 발달, 간 재생 및 종양 형성에 중심적인 역할을 한다는 것을 보여주었습니다. HGF/Met 경로는 p53, cyclin E, cyclin B를 포함한 세포주기 및 세포사멸과 관련된 많은 유전자의 발현을 조절하여 부분 간절제 후 24시간 내에 세포주기를 촉진하고 세포사멸을 억제합니다. ( Paranjpe S et al 2007) STAT-3(signal transducer and activator-3)는 간절제 후 다양한 1차 성장반응 유전자를 조절하는 전사인자이며 다양한 성장인자와 사이토카인에 의해 활성화될 수 있다.(Li W et al 2002) STAT -3 DNA 결합 활성은 PH(부분 간절제술) 30분 이내에 잔여 간에서 증가하고 3시간 이내에 30배로 최고조에 달하며 이러한 증가는 모의 수술 후에 발생하지 않습니다. (Cressman DE et al, 1995) 간 재생의 시작과 완성에는 몇 가지 원발암유전자도 관여하는데, 이들 c-fos 중에서 c-jun과 c-myc가 중요한 유전자이다. 간절제 직후 간에서 C-fos 및 c-jun 전사 수준이 증가하고 2시간 후에 정상으로 돌아옵니다. 이것은 2시간에 정점에 도달하고 4시간에 기저 수준으로 떨어지는 c-myc m RNA의 상승으로 이어집니다. (Fausto N et al 1989; Morello D, 1989) 추가 연구에서 Morello D et al(1990)은 간 절제술 후 c-myc RNA의 증가가 가짜 수술 후보다 몇 배 더 높다는 것을 발견했습니다.

위에서 언급한 요인 외에도 타원형 세포, 대식세포, 혈소판 및 줄기 세포(CD133+)와 같은 여러 세포도 직간접적으로 PHLR에 참여합니다.(Evarts RP et al 1987, Nakamura T et al 1986, Fausto N 2004, Xiang S et al 2012) amEsch JS(2012)의 연구에서 CD 133+ 줄기 세포 주입은 연장된 간 절제술 후 간 보존 및 전반적인 결과를 개선했습니다. T 세포는 또한 간 재생에 영향을 미칠 수 있으며 T 세포와 림프독소가 결핍된 마우스는 간 재생 능력이 감소합니다. (Anders SA et al 2005, Tumanov AV et al 2009) 타원형 세포는 TGF-베타에 의한 억제에 덜 민감하며, 이는 성숙한 간세포의 증식을 현저하게 억제할 수 있으므로 이러한 세포(타원형 세포)는 간 재생을 위한 대체 경로를 제공합니다. (Lenanh NN et al 2007) TGF 베타는 제어되지 않은 간세포 증식의 억제제이며 TGF 베타 m RNA 발현은 세포 분열 및 유사분열의 완료를 향해 정점에 도달하며 EGF 활성에 대한 억제 효과도 있습니다. (Nquyen LN 외 2007, Braun L 외, 1988, Fausto N 외 1990). Romero GJ 외(2005)의 연구에서 TGF 베타 수용체 녹아웃 간절제 마우스는 간세포 증식이 증가하고 간 질량 대 신체 비율이 증가한 것으로 나타났습니다.

Scotte M et al(1997)은 쥐의 소간절제술 및 대간절제술 후 간에서 사이토카인 발현을 연구한 결과, 간절제술 및 대간절제술 후에 TNF와 IL-1이 증가하는 반면, 간절제술(80%) 후에 IL-6 상향 조절이 더 두드러진다는 것을 발견했습니다. Li J et al(2009)은 쥐를 대상으로 대(2/3) 및 부(1/3) 간절제술 후 재생 프로필을 비교했으며, 간절제 후 4, 12, 30시간에서 유전자 발현 프로필은 일부 유전자가 유사하지만 유사한 상향 및 하향 조절을 보였다. 주요 간 절제술 후 우선적인 표현을 보였다. Masson S et al(1999)도 쥐의 간 재생에 대한 절제 범위의 영향을 연구하여 간 절제 범위에 관계없이 재생 반응이 발생하지만 재생 과정과 성장 인자의 발현은 절제된 간의 부피에 따라 다르다고 결론지었습니다. M Nagino et al(2011)은 대대적 간절제술 후 첫 2주 이내에 간이 빠르게 재생되고 그 이후에는 천천히 진행되다가 원래 간 용적의 3/4에 도달하면 멈춘다고 관찰했는데, 보통 간절제술 후 6개월에서 1년 사이에 발생한다. 그들은 또한 절제 범위, 체표면적, 문맥 절제, 문맥 고정화 및 ICG 청소율과 같은 요인이 간 절제술 후 간 부피 재생과 관련이 있음을 발견했습니다.