Badanie mediatorów regeneracji wątroby po hepatektomii

Prospektywne nierandomizowane badanie mające na celu zbadanie ekspresji mediatorów regeneracji wątroby po hepatektomii (PHLR) i porównanie z grupą bez hepatektomii: badanie pilotażowe

Wstęp : Badania eksperymentalne na modelach zwierzęcych po hepatektomii zostały wykorzystane do zbadania mechanizmu regeneracji wątroby. Hepatektomia z powodu różnych chorób i przeszczep wątroby od żywego dawcy stanowią dobry ludzki model do badania mechanizmu regeneracji wątroby in vivo. Badania te są niezbędne do klinicznego zastosowania wiedzy uzyskanej w doświadczeniach na zwierzętach i pokierują dalszymi badaniami mającymi na celu opracowanie nowych metod leczenia niewydolności wątroby, marskości wątroby i raka.

Wstęp :

Wątroba jest ważnym narządem pełniącym różne funkcje metaboliczne i ochronne niezbędne do utrzymania życia i ma wrodzony potencjał regeneracji i przywracania objętości po częściowej resekcji. Regeneracja wątroby po hepatektomii zachodzi głównie poprzez proliferację dojrzałych hepatocytów (Fausto N 2003 & 2004); zmiany hemodynamiki wrotnej i cytokin (IL-6, TNF-α) uważane za najważniejsze czynniki inicjujące ten proces. (Abhshagen K i in. 2012, Scotte M i in. 1997) Sugeruje się, że zwiększone dostarczanie krwi wrotnej do pozostałości wątroby powoduje uszkodzenie naprężenia ścinającego prowadzące do uwolnienia czynników takich jak NO i VEGF, które aktywują kaskadę regeneracji (Marabushi i in. 2004). Cytokiny (IL-6 i TNF-α), NO i VEGF działają na pro HGF (nieaktywny czynnik wzrostu hepatocytów), przekształcając go w aktywny HGF, który działa poprzez receptory Met w celu dalszej aktywacji STAT-3, który jest kluczowym mediatorem wczesnej fazy hepatocytów PHLR. (Abhshgen K i wsp. 2008, Cresman DE i wsp. 1996, Cressman DE1997, Sudo K i wsp. 2008, Borowicak M i wsp. 2004, Paranjpe S i wsp. 2007) Zwiększone dostarczanie krwi wrotnej do pozostałości wątroby również zwiększa dostępność aminokwasów na jednostkę , hormony trzustkowe, endotoksyny pochodzące z jelit i inne czynniki hepatotroficzne, wszystkie one mogą działać bezpośrednio, aktywując replikację DNA. ( Bucher NL i wsp. 1977, Riehle KJ i wsp. 2011) Podawanie mieszaniny aminokwasów nietkniętym szczurom indukuje falę replikacji hepatocytów, a jej pozbawienie blokuje PHLR. (Mead JE i wsp. 1990) Insulina, glukagon i hormon wzrostu również mają znaczący wpływ na regenerację wątroby. (Bucher NLR 1976, Shi min luo i wsp. 2004, Amal ZS i wsp. 2011) Zdolność wątroby do regeneracji po jej częściowej resekcji pozwala na wykonywanie hepatektomii w przypadku przeszczepów wątroby od żywych dawców, nowotworów wątroby i raków dróg żółciowych. Hepatektomia w tych stanach zapewnia nam również dobry model do badania mechanizmu regeneracji wątroby u ludzi in vivo. Badania te są ważne dla klinicznego zastosowania wiedzy uzyskanej w badaniach eksperymentalnych na zwierzętach po hepatektomii. Badania te pomogą nam poznać mediatory różnych faz regeneracji wątroby po hepatektomii (PHLR) i pokierują przyszłymi badaniami w celu opracowania nowych podejść do zapobiegania i leczenia zagrażających życiu powikłań po hepatektomii, takich jak „zespół małego rozmiaru”, niewydolność wątroby . Ślady te pomogą zrozumieć kontrolę proliferacji komórkowej in vivo i mogą okazać się niezbędne do opracowania nowych podejść terapeutycznych do leczenia marskości wątroby i raka.

Hipoteza zerowa: Ekspresja mediatorów regeneracji wątroby po hepatektomii (PHLR) nie różni się w grupie po hepatektomii (grupa badana) i grupie bez hepatektomii (grupa kontrolna).

Cel: Zbadanie mechanizmu regeneracji wątroby po hepatektomii (PHLR) i porównanie ekspresji mediatorów PHLR w grupie po hepatektomii (grupa badana) i grupie bez hepatektomii (grupa kontrolna).

Cele:

1. Badanie mediatorów PHLR w modelu ludzkim.
2. Porównanie ekspresji mediatorów PHLR między hepatektomią (grupa badana) i bez hepatektomii (grupa kontrolna).
3. Badanie początkowych zmian PHLR w tkance wątroby. Pacjent i metoda: Ta prospektywna, nierandomizowana próba zostanie przeprowadzona na dwóch grupach pacjentów — grupie po hepatektomii (badanej) i grupie bez hepatektomii (kontrolnej), a do każdej grupy zostanie włączonych co najmniej 10 kolejnych dorosłych pacjentów (18 lat lub więcej). zgodnie z kryteriami włączenia i wyłączenia podanymi poniżej. Świadoma zgoda zostanie uzyskana od pacjentów w obu grupach. Krew żylna obwodowa (z żyły przedramienia) (6 ml) zostanie pobrana dzień przed zabiegiem i po zabiegu w dniach 1, 3,7, 14 (2 tyg.), 42 (6 tyg.) i 180 (6 tyg.) miesiące). Do małego odgałęzienia żyły wrotnej zostanie wprowadzony cewnik dożylny o średnicy 20 G w celu pomiaru ciśnienia wrotnego i pobrania krwi żylnej wrotnej (6 ml) na początku operacji, ale po wejściu do jamy brzusznej i na końcu operacji, ale przed zamknięcie brzucha. Pobranie próbki krwi z żyły obwodowej (z żyły przedramienia), pomiar ciśnienia wrotnego i pobranie krwi wrotnej zostanie wykonane w obu grupach badawczych, ale pacjenci w grupie poddanej hepatektomii (badanej) zostaną poddani dodatkowemu zabiegowi tj. trucut (igła) biopsja resztek wątroby.

Próbka biopsji wątroby zostanie zakonserwowana w roztworze formaliny i przeniesiona do laboratorium patologii w celu wykrycia początkowych zmian podczas PHLR i ich ewentualnych mediatorów, prawidłowa tkanka wątroby obecna w wyciętej próbce posłuży jako samokontrola. Krew z żyły obwodowej i małych odgałęzień żyły wrotnej zostanie pobrana do standardowej fiolki przeznaczonej do tego celu i przekazana do laboratorium w celu analizy w celu wykrycia mediatorów regeneracji wątroby. Analiza próbki krwi zostanie przeprowadzona metodą ELISHA. Pomiar ciśnienia wrotnego zostanie wykonany poprzez kaniulację małej gałęzi żyły wrotnej (np. żyła nasadowa żołądka) po wejściu do żyły ten cewnik dożylny zostanie podłączony do cyfrowego rejestratora ciśnienia za pomocą rurki łączącej wypełnionej solą fizjologiczną. Ten cyfrowy rejestrator ciśnienia jest dostępny w każdym stanowisku anestezjologicznym (prod. Drager) i zwykle podaje pomiar w mm Hg, zapis ciśnienia będzie wykonywany przed i po operacji, aby obserwować wpływ operacji na ciśnienie wrotne.

Kryteria włączenia: Dorośli chorzy (18 lat i więcej) z nowotworami złośliwymi przewodu pokarmowego wymagającymi częściowej resekcji wątroby (grupa badana) lub resekcji innych odcinków przewodu pokarmowego (grupa kontrolna) i wyrażający chęć udziału w badaniu.

Kryteria wykluczenia – Pacjenci, którzy nie chcą uczestniczyć w badaniu. Pacjenci ze schorzeniami, które mogą wpływać na ekspresję mediatora PHLR (np. immunosupresja, przewlekłe zapalenie wątroby, marskość wątroby, nadciśnienie wrotne, ciąża, stosowanie środków antykoncepcyjnych), pacjenci, u których podczas operacji zostanie wykryty zaawansowana lub nieoperacyjna choroba, zostaną wykluczeni z badania, a zebrane od nich dane nie zostaną uwzględnione w analizie.

Wielkość próby: minimum 10 pacjentów w każdej grupie Projekt: prospektywna, nierandomizowana próba Miejsce badania: Klinika Chirurgii Przewodu Pokarmowego, GBPH i MAMC, New Delhi Czas trwania: 2 lata. Kontynuacja: 6 miesięcy Finansowanie: Badacze będą ubiegać się o finansowanie z agencji rządowych. Mediator PHLR do oznaczania we krwi obwodowej metodą ELISA - IL-1 IL-6, TNF-α, TNF-β, HGF (czynnik wzrostu hepatocytów), GH (hormon wzrostu), insulina i glukagon.

Badanie wycinka wątroby (Immunohistochemia): indeks mitotyczny (Ki 67), EPCAM, STAT-3, receptor dla HGF, VEGF, NKAM i CD133.

Metody statystyczne: Wszystkie dane zostaną wprowadzone do programu Microsoft Excel, a obliczenia statystyczne zostaną wykonane za pomocą oprogramowania SPSS. W celu porównania środków ekspresji różnych czynników tkankowych w tkance wątroby przed i po hepatektomii, badacze powinni zastosować test t dla par, jeśli rozkład zmiennych jest normalny, oraz test rang znaków Wilcoxa dla rozkładu innego niż normalny. W celu porównania ekspresji mediatorów regeneracji wątroby w surowicy pacjentów z grupy badanej i kontrolnej badacze stosują niezależny test t dla rozkładu normalnego i test Manna Whitneya dla rozkładu innego niż normalny. W celu zbadania średnich stężeń mediatorów regeneracji wątroby w różnych punktach czasowych przed i po operacji, badacze zastosują ANOVA dla rozkładu normalnego i test Friedmana dla rozkładu nienormalnego, a następnie test post hoc. Wartość P wynosząca 0,5 lub mniej zostanie wykorzystana do uzyskania istotności.

Przegląd literatury:

Regeneracja wątroby po hepatektomii jest bardzo złożonym i uporządkowanym procesem, który obejmuje proliferację dojrzałych hepatocytów w celu odzyskania objętości wątroby, dokładny mechanizm regeneracji wątroby nie został dotąd poznany, ale dowody oparte na badaniach na zwierzętach (szczury, myszy, psy itp.) zmiana hemodynamiki wrotnej, cytokiny, czynnik wzrostu (HGF, TGF, EGF), hormony (takie jak GH, insulina czy adrenalina) są aktywnie zaangażowane w ten proces kontrolowany przez setki genów. (Fausto N 2012 i Michelopoulos 2010) Marabushi i wsp. (2004) zasugerowali, że ostry wzrost ilości krwi wrotnej dostarczanej do resztek wątroby powoduje uszkodzenie naprężenia ścinającego, które prowadzi do produkcji tlenku azotu (NO), aktywacji kanału wapniowego i uwalniania VEGF; wszystkie odgrywają kluczową rolę w zainicjowaniu procesu regeneracji. Bucher NL (1964) zaobserwował, że zmiany hemodynamiczne w przepływie wrotnym są bezpośrednio związane z rozległością hepatektomii, wzrost ciśnienia wrotnego po 90% hepatektomii jest znacznie większy niż po 70% hepatektomii. Sato i wsp. (1997&1999) ponownie potwierdzili ustalenia Buchera NL, a także zaobserwowali postępujący wzrost ciśnienia wrotnego wraz z postępem regeneracji wątroby i jej spadkiem w kierunku jej zakończenia. Badania eksperymentalne różnych badaczy, takich jak Wang i Lautt (1998), Cantre D i wsp. (2008), Schoen JM i wsp. (2001) oraz Mei Y i wsp. (2011) dodatkowo potwierdziły rolę NO w aktywacji czynników odpowiedzialnych za proliferację hepatocytów. VEGF uwalniany z sinusoidalnego śródbłonka jest odpowiedzią na uszkodzenie naprężenia ścinającego, stymuluje HGF (czynnik wzrostu hepatocytów) do działania na receptory c-met i inicjowania proliferacji hepatocytów. (Paranjpe S i wsp. 2007, Borowiak M i wsp. 2004) Nadciśnienie wrotne związane z marskością wątroby nie prowadzi do uszkodzeń związanych z naprężeniami ścinającymi z powodu kapilaryzacji sinusoidalnych komórek śródbłonka (SEC) i utraty płytek sitowych. (Sato i in. 1997 & Vollmer i in. 1998).

Suenaga M (1983) badając rolę krwi wrotnej w regeneracji wątroby po częściowej hepatektomii u psów zauważył, że odpowiednia ilość krwi wrotnej jest niezbędna do regeneracji wątroby, a wysokie stężenie aminokwasów we krwi wrotnej pozytywnie wpływa na proces regeneracji. W innym badaniu Skov OP i wsp. (1988) zauważyli, że krew wrotna zawiera duże ilości EGF (naskórkowego czynnika wzrostu), hormonów trzustkowych (insulina, glukagon) i innych czynników wzrostu, które aktywnie uczestniczą w regeneracji wątroby. Bucher NL (1976 i 1977) zaobserwował, że zarówno insulina, jak i glukagon ułatwiają regenerację wątroby i syntezę DNA po hepatektomii, ale do tego potrzebny jest czynnik niewrotny, ponieważ oba nie indukują proliferacji hepatocytów w nienaruszonej wątrobie, ale mogą indukować proliferację hepatocytów u szczurów poddanych hepatektomii i wypatroszonych. Oprócz tych dwóch (insuliny i glukagonu) w tym procesie uczestniczą również inne hormony, takie jak hormon wzrostu, adrenalina, serotonina itp. (Amal ZS i wsp., 2011; Shi Min Luo, 2004) IL-6 i TNF-α to dwa czynniki, które są niezbędne do zapoczątkowania PHLR, krew wrotna zawiera czynniki pochodzenia jelitowego, takie jak lipopolisacharydy, czynniki dopełniacza i cząsteczki adhezji międzykomórkowej, które aktywować komórki Kupffera, aby uwolnić IL-6 i TNF-α, które działają parakrynnie, inicjując regenerację. (Fausto N 2006, Michelopoulos 2007, Cressman DE i in. 1996, Feingold KR i in. 1988, Sudo K i in. 2008, Yamada Y i in. 1997, Cornell RP i in. 1985). Il-6,TNF-α, VEGF, NO inicjują regenerację poprzez aktywację HGF (czynnik wzrostu hepatocytów), który jest silnym mitogenem hepatocytów. (Diaz JJ i in. 2011, Cantre D i in. 2008, Rai RM i in. 2005). HGF wraz z naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF), czynnikiem wzrostu fibroblastów (FGF), transformującym czynnikiem wzrostu (TGF), hormonami hepatotropowymi i kilkoma innymi znanymi i nieznanymi czynnikami kontroluje proliferację i propagację hepatocytów. (Fausto N 1993, Fausto N i Mead JE 1989). HGF wiąże receptor Met na hepatocytach i aktywuje ich wzrost i proliferację. (Borowick et al 2004) HGF, EGF i TGF alfa są silnymi mitogenami in vitro, ponieważ mogą indukować proliferację hepatocytów w prawidłowej wątrobie nawet przy braku innych czynników, a w obecności czynników takich jak cytokiny mogą stymulować proliferację znacznej części hepatocytów. (Block GD i in. 1996, Webber EM i in. 1998) TGF-α może indukować syntezę DNA i ekspresję c-myc po dodaniu do hodowli hepatocytów szczura. (Skouteris GG i Menamin MM 1992) Mediatory zapalne, takie jak prostaglandyna (PGE-2), również odgrywają pewną rolę w regeneracji wątroby, ponieważ jej poziom wzrasta po hepatektomii u szczurów, a proces ten jest zależny od c-AMP; Stwierdzono, że dodanie prostaglandyn do hodowli hepatocytów o zwiększa syntezę DNA. (Tsujii H i in., 1993) EGF może stymulować hepatocyty noworodków szczura w hodowli pierwotnej do wejścia w fazy S i M, które można wykryć już po 4 godzinach, a szczyty między 12 a 16 godzinami później spadają i efekt ten można modulować przez czynniki surowicze oraz podawanie glukagonu i insuliny dodatkowo wzmacnia wzrost. (Draghi E i wsp., 1980) HGF odgrywa znaczącą rolę w PHLR, po związaniu się z receptorem met aktywuje STAT-3 (przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji 3), który pośredniczy w indukcji genów wczesnej odpowiedzi, a zmutowane myszy Met wykazały upośledzoną regenerację wątroby .( Borowiak M i wsp. 2004) Huh CG i wsp. w 2004 r. w swoich badaniach na myszach z mutacją Met wykazali, że szlak sygnałowy HGF/C-Met odgrywa centralną rolę w rozwoju, regeneracji wątroby i nowotworzeniu. Szlak HGF/Met reguluje ekspresję wielu genów związanych z cyklem komórkowym i apoptozą, w tym p53, cykliny E i cykliny B, w celu promowania cyklu komórkowego i hamowania apoptozy w ciągu 24 godzin po częściowej hepatektomii. ( Paranjpe S i wsp. 2007) STAT-3 (przetwornik sygnału i aktywator-3) jest czynnikiem transkrypcyjnym, który reguluje różne podstawowe geny odpowiedzi wzrostu po hepatektomii i może być aktywowany przez różne czynniki wzrostu i cytokiny.(Li We et al 2002) Aktywność wiązania DNA STAT-3 wzrasta w resztkach wątroby w ciągu 30 minut od PH (częściowa hepatektomia) i osiąga wartość szczytową do 30-krotnie w ciągu 3 godzin, a wzrost ten nie występuje po pozorowanej operacji. (Cressman DE i in., 1995) Kilka protoonkogenów jest również zaangażowanych w inicjację i zakończenie regeneracji wątroby, z których c-fos, c-jun i c-myc są ważnymi genami. Poziomy transkryptów C-fos i c-jun wzrastają w wątrobie niemal natychmiast po hepatektomii i wracają do normy po 2 godzinach. Następnie następuje podwyższenie c-myc m RNA, które osiąga szczyt po 2 godzinach i spada do poziomu podstawowego po 4 godzinach. (Fausto N i wsp. 1989; Morello D, 1989) W dalszych badaniach Morello D i wsp. (1990) stwierdzili, że wzrost c-myc RNA po hepatektomii jest wielokrotnie wyższy niż po operacji pozorowanej.

Oprócz czynników wymienionych powyżej kilka komórek, takich jak komórki owalne, makrofagi, płytki krwi i komórki macierzyste (CD133+), również uczestniczy w PHLR bezpośrednio lub pośrednio. (Evarts RP i wsp. 1987, Nakamura T i wsp. 1986, Fausto N 2004, Xiang S i wsp. 2012) W badaniu przeprowadzonym przez amEsch JS (2012) infuzja komórek macierzystych CD 133+ poprawiła rezerwę wątrobową i ogólny wynik po rozszerzonej hepatektomii. Komórki T mogą również wpływać na regenerację wątroby, a myszy z niedoborem limfocytów T i limfotoksyny mają zmniejszoną zdolność regeneracji wątroby. (Anders SA i in. 2005, Tumanov AV i in. 2009) Komórki owalne są mniej wrażliwe na hamowanie przez TGF-beta, który może znacznie hamować proliferację dojrzałych hepatocytów, więc te komórki (komórki owalne) zapewniają alternatywną drogę regeneracji wątroby. (Lenanh NN i wsp. 2007) TGF beta jest inhibitorem niekontrolowanej proliferacji heptocytów, a ekspresja mRNA TGF beta osiąga szczyt w kierunku zakończenia podziału komórki i mitozy, ma również działanie hamujące na aktywność EGF. (Nquyen LN i in. 2007, Braun L. i in., 1988, Fausto N i in. 1990). W badaniu przeprowadzonym przez Romero GJ i in. (2005) myszy z heptektomią z nokautem receptora TGF beta wykazały zwiększoną proliferację hepatocytów i zwiększony stosunek masy wątroby do masy ciała.

Scotte M i wsp. (1997) badali ekspresję cytokin w wątrobie po mniejszej i większej hepatektomii u szczurów i stwierdzili, że poziom TNF i IL-1 wzrasta po mniejszej i większej hepatektomii, podczas gdy regulacja w górę IL-6 jest bardziej widoczna po większej (80%) hepatektomii. Li J i wsp. (2009) porównali profil regeneracji po większej (2/3) i mniejszej (1/3) hepatektomii u szczurów, profile ekspresji genów po 4, 12 i 30 godzinach po hepatektomii wykazały podobną regulację w górę i w dół, chociaż niektóre geny wykazywał preferencyjną ekspresję po dużej hepatektomii. Masson S i wsp. (1999) również badali wpływ rozległości resekcji na regenerację wątroby u szczurów i doszli do wniosku, że odpowiedź regeneracyjna zachodzi niezależnie od rozległości hepatektomii, ale przebieg regeneracji i ekspresja czynników wzrostu różni się w zależności od objętości reseowanej wątroby. M Nagino i wsp. (2011) zaobserwowali, że wątroba regeneruje się szybko w ciągu pierwszych dwóch tygodni po dużej hepatektomii, a następnie postępuje powoli i zatrzymuje się, gdy osiągnie 3/4 pierwotnej objętości wątroby, co zwykle ma miejsce od 6 miesięcy do 1 roku po hepatektomii. Zauważyli również, że czynniki takie jak rozległość resekcji, powierzchnia ciała, resekcja żyły wrotnej, emobilizacja żyły wrotnej oraz klirens ICG są związane z regeneracją objętości wątroby po hepatektomii.