Studie av mediatorer av posthepatektomi leverregenerering

Prospektiv ikke-randomisert studie for å studere uttrykk for mediatorer av posthepatektomi leverregenerering (PHLR) og sammenligne med en ikke-hepatektomigruppe: en pilotstudie

Bakgrunn: Eksperimentelle studier ved bruk av dyremodeller etter hepatektomi har blitt brukt for å studere mekanismen for leverregenerering. Hepatectomy for ulike sykdommer og levende donor levertransplantasjon gir en god menneskelig modell for å studere in vivo mekanisme for leverregenerering. Disse studiene er nødvendige for klinisk anvendelse av kunnskapen som er oppnådd ved dyreforsøk og vil lede videre forskning for å utvikle nye modaliteter for håndtering av leversvikt, skrumplever og kreft.

Introduksjon:

Leveren er et livsviktig organ som tjener ulike metabolske og beskyttende funksjoner som er nødvendige for å opprettholde liv, og den har et iboende potensial til å regenerere og gjenopprette volumet etter dens delvise reseksjon. Leverregenerering etter hepatektomi skjer hovedsakelig ved proliferasjon av modne hepatocytter (Fausto N 2003 & 2004); endringer i portalhemodianmik og cytokiner (IL-6, TNF-α) anses som de viktigste triggerfaktorene for denne prosessen. (Abhshagen K et al 2012, Scotte M et al 1997) Det foreslås at økt levering av portalblod til restlever produserer skjærspenningsskade som fører til frigjøring av faktorer som NO og VEGF som aktiverer regenereringskaskaden (Marabushi et al 2004). Cytokiner (IL-6 og TNF-α), NO og VEGF virker på pro HGF (inaktiv hepatocytt-vekstfaktor) for å omdanne den til aktiv HGF som virker gjennom Met-reseptorer for å aktivere STAT-3 ytterligere, som er en nøkkelmediator for tidlig fase av PHLR. (Abhshgen K et al 2008, Cresman DE et al 1996, Cressman DE1997, Sudo K et al 2008, Borowicak M et al 2004, Paranjpe S et al 2007) Økt levering av portalblod til restlever øker også tilgjengeligheten av aminosyreenheter per enhet , bukspyttkjertelhormoner, tarmavledede endotoksiner og andre hepatotrofiske faktorer, kan alle disse virke direkte for å aktivere DNA-replikasjon. (Bucher NL et al 1977, Riehle KJ et al 2011) Administrering av aminosyreblanding til intakte rotter induserer en bølge av hepatocyttreplikasjon, og dens deprivasjon blokkerer PHLR. (Mead JE et al 1990) Insulin, glukagon og veksthormon har også en betydelig innvirkning på leverregenerering. (Bucher NLR 1976, Shi min luo et al 2004, Amal ZS et al 2011) Leverens evne til å regenerere etter den delvise reseksjonen tillater oss å utføre hepatektomi for levertransplantasjon fra levende donorer, hepatiske neoplasmer og gallekreft. Hepatektomi for disse forholdene gir oss også en god modell for å studere in vivo-mekanismen for leverregenerering hos mennesker. Disse studiene er viktige for den kliniske anvendelsen av kunnskapen oppnådd ved eksperimentelle studier på dyr etter hepatektomi. Disse studiene vil hjelpe oss å kjenne mediatorene til ulike faser av posthepatektomi leverregenerering (PHLR) og vil veilede fremtidig forskning for å utvikle nye tilnærminger for forebygging og behandling av livstruende posthepatektomikomplikasjoner som "Small for size syndrom", leversvikt . Disse stiene vil bidra til å forstå in vivo kontroll av cellulær spredning og kan vise seg å være avgjørende for å utvikle nye terapeutiske tilnærminger for å behandle skrumplever og kreft.

Nullhypotese: Uttrykk av mediatorer av posthepatektomi leverregenerering (PHLR) er ikke forskjellig mellom hepatektomi (studiegruppe) og ikke-hepatektomigruppe (kontrollgruppe).

Mål: Å studere mekanismen for posthepatektomi leverregenerering (PHLR) og sammenligne uttrykk for mediatorer av PHLR mellom hepatektomi (studiegruppe) og en ikke-hepatektomigruppe (kontrollgruppe).

Mål:

1. For å studere mediatorene til PHLR i menneskelig modell.
2. For å sammenligne uttrykk for mediatorer PHLR mellom hepatektomi (studiegruppe) og ikke-hepatektomi (kontrollgruppe).
3. For å studere innledende endringer av PHLR i levervev. Pasient og metode: Dette prospektive ikke-randomiserte sporet vil bli utført på to grupper av pasientene - hepatektomi (studie) gruppe og ikke-hepatektomi (kontroll) gruppe og minimum 10 påfølgende voksne (18 år eller mer) pasienter vil bli rekruttert i hver gruppe i henhold til inklusjons- og eksklusjonskriterier gitt nedenfor. Det vil innhentes informert samtykke fra pasientene i begge gruppene. Perifert (fra en underarmsvene) venøst ​​blod (6 ml) vil bli samlet inn en dag før operasjonen og etter operasjonen på postoperativ dag 1, 3,7, 14 (2 uker), 42 (6 uker) og 180 (6) måneder). En liten gren av portalvenen vil bli kanylert et 20 gauge intravenøst ​​kateter for måling av portaltrykket og oppsamling av portalvenøst ​​blod (6 ml) ved starten av operasjonen, men etter inngangen i buken og ved slutten av operasjonen, men før lukking av magen. Innsamling av blodprøve fra en perifer vene (underarmsvene), måling av portaltrykk og innsamling av portalblod vil bli gjort i begge studiegruppene, men pasienter i hepatektomi (studie) gruppen vil gjennomgå en tilleggsprosedyre, dvs. trucut (nål) biopsi fra restlever.

Leverbiopsiprøver vil bli konservert i formalinløsning og overført til patologilaboratoriet for å oppdage innledende endringer under PHLR og deres mulige mediatorer, normalt levervev tilstede i resekert prøve vil tjene som selvkontroll. Blod fra perifer vene og små grener av portvenen vil bli samlet i standard hetteglass brukt til dette formålet og overført til laboratoriet for analyse for å oppdage mediatorer av leverregenerering. Analysen av blodprøven vil bli gjort ved å bruke ELISHA-metoden. Måling av portaltrykket vil bli gjort ved kanulering av en liten gren av portalvenen (f. Gastro epiploisk vene) etter inngangen i venen vil dette intravenøse kateteret kobles til en digital trykkskriver via et forbindelsesrør fylt med vanlig saltvann. Denne digitale trykkskriveren er tilgjengelig i hver av anestesiarbeidsstasjonene ( Merke: Drager) og den gir vanligvis måling i mm Hg, trykkregistreringen vil bli gjort før og etter operasjonen for å observere effekten av kirurgi på portaltrykket.

Inklusjonskriterier: Voksne pasienter (18 år eller mer) med ondartede neoplasmer i mage-tarmkanalen som krever enten delvis reseksjon av lever (studiegruppe) eller reseksjon av andre deler av mage-tarmkanalen (kontrollgruppe) og er villige til å delta i studien.

Eksklusjonskriterier- Pasienter som ikke er villige til å delta i studien. Pasienter med tilstander som kan påvirke uttrykket av mediator av PHLR (f. immunsuppresjon, kronisk hepatitt, cirrhose, portal hypertensjon, graviditet, bruk av prevensjon), vil pasienter som viser seg å ha en fremskreden eller inoperabel sykdom på under operasjonen bli ekskludert fra studien og data samlet inn fra dem vil ikke bli inkludert i analysen.

Prøvestørrelse: Minimum 10 pasienter i hver gruppe Design: prospektivt ikke-randomisert spor Studiested: Avdeling for gastrointestinal kirurgi, GBPH og MAMC, New Delhi Varighet: 2 år. Oppfølging: 6 måneder Finansiering: Utrederne vil søke om midler fra offentlige etater. Mediator av PHLR som skal analyseres i perifert blod ved ELISA-metoden - IL-1 IL-6, T N F-α, TNF-β, HGF (hepatocytt growth factor), GH (veksthormon), Insulin og Glukagon.

Undersøkelse av leverbiopsiprøve (Immunohistokjemi): mitotisk indeks (Ki 67), EPCAM, STAT-3, reseptor for HGF, VEGF, NKAM og CD133.

Statistiske metoder: Alle data vil bli lagt inn i Microsoft excel og statistiske beregninger vil bli utført med SPSS-programvare. For å sammenligne middelene for uttrykket av ulike vevsfaktorer i levervev før og etter hepatektomi, skal etterforskerne bruke paret t-test hvis fordelingen av variabler er normal og Wilcox-on sign rank test for en ikke-normal fordeling. For å sammenligne uttrykket av mediatorer for leverregenerering i serum fra pasienter i studie- og kontrollgrupper skal etterforskerne bruke uavhengig t-test for normalfordeling og Mann Whitney-test for ikke-normalfordeling. For å studere gjennomsnittene av serumnivåer av mediatorer av leverregenerering på forskjellige tidspunkt før og etter operasjonen, skal etterforskerne bruke ANOVA for en normalfordeling og Friedman-test for en ikke-normal fordeling etterfulgt av post hoc-test. P-verdi på 0,5 eller lavere vil bli brukt for å utlede signifikans.

Litteraturanmeldelse:

Leverregenerering etter hepatektomi er en veldig kompleks og ryddig prosess som involverer spredning av modne hepatocytter for å gjenvinne levervolum, nøyaktig mekanisme for leverregenerering har ikke blitt utfoldet til nå, men bevis basert på dyreforskning (rotte, mus, hund etc) indikerer at akutt endring i portalhemodynamikk, cytokiner, vekstfaktor (HGF,TGF,EGF), hormoner (som GH, insulin eller adrenalin) er aktivt involvert i denne prosessen som kontrolleres av hundrevis av gener. (Fausto N 2012 og Michelopoulos 2010) Marabushi et al (2004) foreslo at akutt økning i mengde portalblodtilførsel til den resterende leveren produserer en skjærspenningsskade som fører til produksjon av nitrogenoksid (NO), aktivering av kalsiumkanal og frigjøring av VEGF; alle spiller en nøkkelrolle i initieringen av regenereringsprosessen. Bucher NL (1964) observerte at hemodynamiske endringer i portalblodstrømmen er direkte relatert til omfanget av hepatektomi, økning i portaltrykk etter 90 % hepatektomi er mye høyere enn etter 70 % hepatektomi. Sato et al (1997&1999) bekreftet funnene til Bucher NL og observerte også en progressiv økning av portaltrykket ettersom leverregenereringen skrider frem og dens nedgang mot fullføringen. Eksperimentelle studier av forskjellige forskere som Wang og Lautt (1998), Cantre D et al (2008), Schoen JM et al (2001) og Mei Y et al (2011) bekreftet ytterligere rollen til NO i aktivering av faktorer som er ansvarlige for hepatocyttproliferasjon. VEGF frigitt fra sinusformet endotel er respons på skjærspenningsskade stimulere HGF (hepatocyte growth factor) til å virke på c-met-reseptorer og initiere hepatocyttproliferasjon. (Paranjpe S et al 2007, Borowiak M et al 2004) Portal hypertensjon assosiert med skrumplever fører ikke til skjærspenningsassosiert skade på grunn av kapillarisering av sinusformede endotelceller (SECs) og tap av silplater. (Sato et al 1997 & Vollmer et al 1998).

Suenaga M (1983) studerte rollen til portalblod i leverregenerering etter delvis hepatektomi hos hunder og la merke til at tilstrekkelig mengde portalblod er nødvendig for hepatisk regenerering og høy konsentrasjon av aminosyrer i portalblodet har en positiv innvirkning på regenereringsprosessen. I en annen studie bemerket Skov OP et al (1988) at portalblod inneholder høye mengder EGF (epidermal vekstfaktor), pankreashormoner (insulin, glukagon) og andre vekstfaktorer som deltar aktivt i leverregenerering. Bucher NL (1976 og 1977) observerte at insulin og glukagon både letter leverregenerering og DNA-syntese etter hepatektomi, men en eller annen ikke-portalfaktor er nødvendig for dette da begge ikke klarte å indusere hepatocyttproliferasjon i en intakt lever, men de kan indusere hepatocyttproliferasjon i hepatectomized og eviscerated rotter. I tillegg til disse to (insulin og glukagon) deltar også andre hormoner som veksthormon, Nor adrenalin, serotonin osv. i denne prosessen. (Amal ZS et al, 2011; Shi Min Luo, 2004) IL-6 og TNF-α er to faktorer som er avgjørende for initiering av PHLR, portalblod inneholder tarmavledede faktorer som lipopolysakkarider, komplementfaktorer og intercellulære adhesjonsmolekyler som aktivere Kupffer-celler for å frigjøre IL-6 og TNF-α som virker på parakrin måte for å starte regenerering.(Fausto N 2006, Michelopoulos 2007, Cressman DE et al 1996, Feingold KR et al 1988, Sudo K et al 2008, Yamada Y et al 1997, Cornell RP et al 1985). Il-6,TNF-α, VEGF, NO initierer regenerering ved å aktivere HGF (hepatocytt growth factor) som er et potent hepatocyttmitogen. (Diaz JJ et al 2011, Cantre D et al 2008, Rai RM et al 2005). HGF sammen med epidermal vekstfaktor (EGF), fibroblastvekstfaktor (FGF), transformerende vekstfaktor (TGF), hepatotrofiske hormoner og flere andre kjente og ukjente faktorer kontrollerer hepatocyttproliferasjon og forplantning. (Fausto N 1993, Fausto N og Mead JE 1989). HGF binder Met-reseptoren på hepatocytter og aktiverer deres vekst og spredning.(Borowick et al 2004) HGF, EGF og TGF alfa er potente in vitro mitogener da de kan indusere hepatocyttproliferasjon i en normal lever selv i fravær av andre faktorer og i nærvær av faktorer som cytokiner kan de stimulere spredning av en betydelig andel av hepatocytter. (Blokk GD et al 1996, Webber EM et al 1998) TGF-a kan indusere DNA-syntese og c-myc-ekspresjon når det tilsettes til rottehepatocyttkultur. (Skouteris GG og Menamin MM 1992) Inflammatoriske mediatorer som Prostaglandin (PGE-2) spiller også en viss rolle i leverregenerering ettersom nivået øker etter hepatektomi hos rotter, og denne prosessen er avhengig av c-AMP; tilsetning av prostaglandiner til hepatocyttkultur har vist seg å øke DNA-syntesen. (Tsujii H et al, 1993) EGF kan stimulere neonatal rottehepatocytt i primærkultur til å gå inn i S- og M-faser, som kan påvises så tidlig som 4 timer og topper mellom 12 og 16 timer deretter, og denne effekten kan moduleres. ved serumfaktorer og administrering av glukagon og insulin forsterker veksten ytterligere. (Draghi E et al, 1980) HGF har en betydelig rolle i PHLR, etter binding med reseptor aktiverer den STAT-3 (signaltransducer og aktivator av transkripsjon 3) som medierer induksjon av tidlige responsgener og Met mutante mus har vist nedsatt leverregenerering .( Borowiak M et al 2004) Huh CG et al i 2004 viste ved deres studie på Met mutante mus at HGF/C-Met signalvei spiller en sentral rolle i utvikling, leverregenerering og tumorigenese. HGF/Met-veien regulerer ekspresjon av mange gener relatert til cellesyklus og apoptose, inkludert p53, cyclin E og cyclin B, for å fremme cellesyklus og hemme apoptose i 24 timer etter delvis hepatektomi. (Paranjpe S et al 2007) STAT-3 (signaltransduser og aktivator-3) er en transkripsjonsfaktor som regulerer ulike primære vekstresponsgener etter hepatektomi og den kan aktiveres av ulike vekstfaktorer og cytokiner.(Li W et al 2002) STAT -3 DNA-bindende aktivitet øker i restlever innen 30 minutter etter PH (partiell hepatektomi) og topper seg til 30 ganger innen 3 timer, og denne økningen skjer ikke etter falsk kirurgi. (Cressman DE et al, 1995) Flere proto-onkogener er også involvert i initiering og fullføring av leverregenerering, av disse c-fos er c-jun og c-myc viktige gener. C-fos og c-jun transkripsjonsnivåer øker i leveren nesten umiddelbart etter hepatektomi og går tilbake til det normale innen 2 timer. Dette etterfølges av forhøyelse av c-myc m RNA som når toppen etter 2 timer og faller til basalnivå etter 4 timer. (Fausto N et al 1989; Morello D, 1989) I en ytterligere studie fant Morello D et al (1990) at økningen i c-myc RNA etter hepatektomi er mange ganger høyere enn etter sham kirurgi.

I tillegg til faktorene nevnt ovenfor deltar flere celler som ovale celler, makrofager, blodplater og stamceller (CD133+) også i PHLR direkte eller indirekte.(Evarts RP et al 1987, Nakamura T et al 1986, Fausto N 2004, Xiang S et al 2012) I en studie av amEsch JS (2012) forbedret infusjon av CD 133+ stamceller leverreserve og totalt resultat etter utvidet hepatektomi. T-celler kan også påvirke leverregenerering og mus med mangel på T-celler og lymfotoksin har redusert evne til leverregenerering. (Anders SA et al 2005, Tumanov AV et al 2009) Ovale celler er mindre følsomme hemming av TGF-beta, som betydelig kan hemme spredningsmodne hepatocytter, så disse cellene (ovale celler) gir en alternativ rute for leverregenerering. (Lenanh NN et al 2007) TGF beta er en hemmer av ukontrollert heaptocyttproliferasjon og TGF beta m RNA-ekspresjon når toppen mot fullføring av celledeling og mitose, den har også hemmende effekt på EGF-aktivitet. (Nquyen LN et al 2007, Braun L et al, 1988, Fausto N et al 1990). I en studie av Romero GJ et (2005) viste TGF beta-reseptor knockout heptektomiserte mus økt hepatocyttproliferasjon og økt levermasse til kroppsforhold.

Scotte M et al (1997) studerte cytokinekspresjon i leveren etter mindre og større hepatektomi hos rotter og fant at TNF og IL-1 øker etter mindre og større hepatektomi mens IL-6 oppregulering er mer fremtredende etter større (80 %) hepatektomi. Li J et al (2009) sammenlignet regenereringsprofilen etter større (2/3rd) og mindre (1/3rd) hepatektomi hos rotter, genekspresjonsprofiler 4, 12 og 30 timer etter hepatektomi viste lignende opp- og nedregulering, selv om noen gener viste foretrukket uttrykk etter større hepatektomi. Masson S et al (1999) studerte også innvirkningen av reseksjonsgrad på leverregenerering hos rotter og konkluderte med at regenerativ respons forekommer uansett omfanget av hepatektomi, men forløpet av regenerering og uttrykk for vekstfaktorer varierer i henhold til volumet av resekert lever. M Nagino et al (2011) observerte at leveren regenererer raskt i løpet av de første to ukene etter større hepatektomi og deretter utvikler den seg sakte og stopper når den når 3/4 av det opprinnelige levervolum, som vanligvis skjer 6 måneder til 1 år etter hepatektomien. De la også merke til at faktorer som utstrekning av reseksjon, kroppsoverflate, portalvenereseksjon, portalvenemobilisering og ICG-clearance er assosiert med regenererende levervolum etter hepatektomi.