Estudo dos Mediadores da Regeneração Hepática Pós-Hepatectomia

Estudo prospectivo não randomizado para estudar a expressão de mediadores da regeneração hepática pós-hepatectomia (PHLR) e comparar com um grupo sem hepatectomia: um estudo piloto

Introdução: Estudos experimentais usando modelos animais pós-hepatectomia têm sido usados ​​para estudar o mecanismo de regeneração do fígado. A hepatectomia para várias doenças e o transplante de fígado de doador vivo fornecem um bom modelo humano para estudar o mecanismo in vivo da regeneração do fígado. Esses estudos são necessários para a aplicação clínica do conhecimento obtido por experimentos com animais e orientarão pesquisas futuras para desenvolver novas modalidades para o manejo da insuficiência hepática, cirrose e câncer.

Introdução :

O fígado é um órgão vital que desempenha várias funções metabólicas e protetoras necessárias para a manutenção da vida e possui potencial inerente para regenerar e restaurar o volume após sua ressecção parcial. A regeneração hepática após hepatectomia ocorre principalmente pela proliferação de hepatócitos maduros (Fausto N 2003 & 2004); alterações na hemodinâmica portal e citocinas (IL-6, TNF-α) consideradas como os fatores desencadeantes mais importantes para este processo. (Abhshagen K et al 2012, Scotte M et al 1997) Propõe-se que o aumento da entrega de sangue portal ao fígado remanescente produz lesão por tensão de cisalhamento levando à liberação de fatores como NO e VEGF que ativam a cascata de regeneração (Marabushi et al 2004). As citocinas (IL-6 e TNF-α), NO e VEGF atuam no pró-HGF (fator de crescimento de hepatócitos inativo) para convertê-lo em HGF ativo que atua através dos receptores Met para ativar ainda mais o STAT-3, que é um mediador chave da fase inicial da PHLR. (Abhshgen K et al 2008,Cresman DE et al 1996, Cressman DE1997, Sudo K et al 2008, Borowicak M et al 2004, Paranjpe S et al 2007) O aumento da distribuição de sangue portal para o fígado remanescente também aumenta por unidade de disponibilidade de aminoácidos , hormônios pancreáticos, endotoxinas derivadas do intestino e outros fatores hepatotróficos, todos eles podem atuar diretamente para ativar a replicação do DNA. (Bucher NL et al 1977, Riehle KJ et al 2011) A administração de mistura de aminoácidos a ratos intactos induz uma onda de replicação de hepatócitos e sua privação bloqueia PHLR. (Mead JE et al 1990) A insulina, o glucagon e o hormônio do crescimento também têm um impacto significativo na regeneração do fígado. (Bucher NLR 1976, Shi min luo et al 2004, Amal ZS et al 2011) A capacidade do fígado de se regenerar após sua ressecção parcial nos permite realizar hepatectomia para transplante de fígado de doador vivo, neoplasias hepáticas e cânceres biliares. A hepatectomia para essas condições também nos fornece um bom modelo para estudar o mecanismo in vivo da regeneração hepática em seres humanos. Esses estudos são importantes para a aplicação clínica do conhecimento obtido por estudos experimentais em animais pós-hepatectomia. Esses estudos nos ajudarão a conhecer os mediadores de várias fases da regeneração hepática pós-hepatectomia (PHLR) e orientarão pesquisas futuras para desenvolver novas abordagens para a prevenção e gerenciamento de complicações pós-hepatectomia com risco de vida, como "Síndrome do tamanho pequeno", insuficiência hepática . Essas trilhas ajudarão a entender o controle in vivo da proliferação celular e podem ser vitais para desenvolver novas abordagens terapêuticas para tratar a cirrose e o câncer.

Hipótese nula: A expressão dos mediadores da regeneração hepática pós-hepatectomia (PHLR) não é diferente entre os grupos hepatectomia (grupo de estudo) e não hepatectomia (grupo controle).

Objetivo: Estudar o mecanismo de regeneração hepática pós-hepatectomia (PHLR) e comparar a expressão de mediadores de PHLR entre hepatectomia (grupo de estudo) e um grupo sem hepatectomia (grupo controle).

Objetivos :

1. Estudar os mediadores do PHLR em modelo humano.
2. Comparar a expressão dos mediadores PHLR entre hepatectomia (grupo de estudo) e não hepatectomia (grupo controle).
3. Estudar as alterações iniciais do PHLR no tecido hepático. Paciente e método: Esta trilha prospectiva não randomizada será conduzida em dois grupos de pacientes - grupo de hepatectomia (estudo) e grupo de não hepatectomia (controle) e no mínimo 10 pacientes adultos consecutivos (18 anos ou mais) serão recrutados em cada grupo de acordo com os critérios de inclusão e exclusão abaixo. O consentimento informado será obtido dos pacientes em ambos os grupos. Sangue venoso periférico (de uma veia do antebraço) (6 ml) será coletado um dia antes da cirurgia e no pós-operatório nos dias 1, 3, 7, 14 (2 semanas), 42 (6 semanas) e 180 (6 semanas) pós-operatórios. meses). Um pequeno ramo da veia porta será canulado um cateter intravenoso de calibre 20 para medição da pressão portal e coleta de sangue venoso portal (6 ml) no início da cirurgia, mas após a entrada no abdômen e no final da cirurgia, mas antes fechamento do abdômen. A coleta da amostra de sangue de uma veia periférica (veia do antebraço), a medição da pressão portal e a coleta do sangue portal serão feitas em ambos os grupos de estudo, mas os pacientes do grupo de hepatectomia (estudo) serão submetidos a um procedimento adicional, ou seja, trucut (agulha) biópsia do fígado remanescente.

O espécime da biópsia hepática será preservado em solução de formalina e transferido para o laboratório de patologia para detectar alterações iniciais durante o PHLR e seus possíveis mediadores, o tecido hepático normal presente no espécime ressecado servirá como autocontrole. O sangue da veia periférica e pequenos ramos da veia porta será coletado em frasco padrão utilizado para este fim e encaminhado ao laboratório para análise para detecção de mediadores da regeneração hepática. A análise da amostra de sangue será feita usando o método ELISHA. A medição da pressão portal será feita pela canulação de um pequeno ramo da veia porta (p. Veia gastroepiplóica) após a entrada na veia, este cateter intravenoso será conectado a um registrador de pressão digital por meio de um tubo de conexão preenchido com solução salina normal. Este registrador de pressão digital está disponível em cada estação de trabalho de anestesia (Fabrica: Drager) e geralmente fornece medições em mm Hg, o registro de pressão será feito antes e depois da cirurgia para observar o efeito da cirurgia na pressão portal.

Critérios de inclusão: Pacientes adultos (18 anos ou mais) com neoplasias malignas do trato gastrointestinal que requerem ressecção parcial do fígado (grupo de estudo) ou ressecção de outras partes do trato gastrointestinal (grupo controle) e estão dispostos a participar do estudo.

Critérios de exclusão- Pacientes que não desejam participar do estudo. Pacientes com condições que podem afetar a expressão do mediador de PHLR (por exemplo, imunossupressão, hepatite crônica, cirrose, hipertensão portal, gravidez, uso de anticoncepcionais), pacientes com doença avançada ou inoperável durante a cirurgia serão excluídos do estudo e os dados coletados deles não serão incluídos na análise.

Tamanho da amostra: Mínimo de 10 pacientes em cada grupo Projeto: trilha prospectiva não randomizada Local do estudo: Departamento de Cirurgia Gastrointestinal, GBPH e MAMC, Nova Deli Duração: 2 anos. Acompanhamento: 6 meses Financiamento: Os investigadores solicitarão financiamento de agências governamentais. Mediador de PHLR a ser analisado em sangue periférico pelo método ELISA - IL-1 IL-6, T N F-α, TNF-β, HGF (fator de crescimento de hepatócitos), GH (hormônio de crescimento), Insulina e Glucagon.

Exame de amostra de biópsia hepática (Imunohistoquímica): índice mitótico ( Ki 67), EPCAM, STAT-3, receptor para HGF, VEGF, NKAM e CD133.

Métodos estatísticos: Todos os dados serão inseridos no Microsoft Excel e os cálculos estatísticos serão realizados no software SPSS. Para comparar as médias da expressão de vários fatores teciduais no tecido hepático antes e depois da hepatectomia, os investigadores devem usar o teste t pareado se a distribuição das variáveis ​​for normal e o teste de Wilcox-on sign rank para uma distribuição não normal. Para comparar a expressão dos mediadores da regeneração hepática no soro dos pacientes dos grupos de estudo e controle, os investigadores devem usar o teste t independente para uma distribuição normal e o teste de Mann Whitney para uma distribuição não normal. Para estudar as médias dos níveis séricos dos mediadores da regeneração hepática em diferentes momentos antes e depois da cirurgia, os investigadores usarão ANOVA para distribuição normal e teste de Friedman para distribuição não normal seguido de teste post hoc. O valor P de 0,5 ou inferior será usado para obter significância.

Revisão da literatura:

A regeneração do fígado após a hepatectomia é um processo muito complexo e ordenado que envolve a proliferação de hepatócitos maduros para recuperar o volume do fígado, o mecanismo exato da regeneração do fígado não foi revelado até agora, mas evidências baseadas em pesquisas com animais (rato, camundongos, cães, etc.) alteração na hemodinâmica portal, citocinas, fator de crescimento (HGF, TGF, EGF), hormônios (como GH, insulina ou adrenalina) estão ativamente envolvidos neste processo que é controlado por centenas de genes. (Fausto N 2012 e Michelopoulos 2010) Marabushi et al (2004) propuseram que o aumento agudo na quantidade de sangue portal para o fígado remanescente produz uma lesão por tensão de cisalhamento que leva à produção de óxido nítrico (NO), ativação do canal de cálcio e liberação de VEGF; todos eles desempenham um papel fundamental na iniciação do processo de regeneração. Bucher NL (1964) observou que as alterações hemodinâmicas no fluxo sanguíneo portal estão diretamente relacionadas à extensão da hepatectomia, o aumento da pressão portal após hepatectomia de 90% é muito maior do que após hepatectomia de 70%. Sato et al (1997&1999) reconfirmaram os achados de Bucher NL e também observaram um aumento progressivo da pressão portal à medida que a regeneração hepática progride e seu declínio até sua conclusão. Estudos experimentais de vários pesquisadores como Wang e Lautt (1998), Cantre D et al (2008,)Schoen JM et al (2001) e Mei Y et al (2011) confirmaram ainda mais o papel do NO na ativação de fatores responsáveis ​​pela proliferação de hepatócitos. O VEGF liberado do endotélio sinusoidal é uma resposta à lesão por estresse de cisalhamento que estimula o HGF (fator de crescimento de hepatócitos) a atuar nos receptores c-met e iniciar a proliferação de hepatócitos. (Paranjpe S et al 2007, Borowiak M et al 2004) A hipertensão portal associada à cirrose não leva a lesão associada ao estresse de cisalhamento devido à capilarização das células endoteliais sinusoidais (SECs) e perda de placas crivadas. (Sato e outros 1997 & Vollmer e outros 1998).

Suenaga M (1983) estudou o papel do sangue portal na regeneração hepática após hepatectomia parcial em cães e observou que uma quantidade adequada de sangue portal é necessária para a regeneração hepática e alta concentração de aminoácidos no sangue portal tem um impacto positivo no processo de regeneração. Em outro estudo, Skov OP et al (1988) observaram que o sangue portal contém grande quantidade de EGF (fator de crescimento epidérmico), hormônios pancreáticos (insulina, glucagon) e outros fatores de crescimento que participam ativamente da regeneração hepática. Bucher NL (1976 e 1977) observou que a insulina e o glucagon facilitam a regeneração hepática e a síntese de DNA após a hepatectomia, mas algum fator não portal é necessário para isso, pois ambos falharam em induzir a proliferação de hepatócitos em um fígado intacto, mas podem induzir a proliferação de hepatócitos em ratos hepatectomizados e eviscerados. Além desses dois (Insulina e Glucagon) outros hormônios como hormônio do crescimento, noradrenalina, serotonina etc também participam desse processo. (Amal ZS et al, 2011; Shi Min Luo, 2004) IL-6 e TNF-α são dois fatores vitais para o início da PHLR, o sangue portal contém fatores derivados do intestino, como lipopolissacarídeos, fatores de complemento e moléculas de adesão intercelular que ativam as células de Kupffer para liberar IL-6 e TNF-α que agem de forma parácrina para iniciar a regeneração.(Fausto N 2006, Michelopoulos 2007, Cressman DE et al 1996, Feingold KR et al 1988, Sudo K et al 2008, Yamada Y et al 1997, Cornell RP et al 1985). Il-6,TNF-α, VEGF, NO iniciam a regeneração ativando o HGF (fator de crescimento de hepatócitos), que é um potente mitógeno de hepatócitos. (Diaz JJ et al 2011, Cantre D et al 2008, Rai RM et al 2005). O HGF junto com o fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento transformador (TGF), hormônios hepatotróficos e vários outros fatores conhecidos e desconhecidos controlam a proliferação e propagação de hepatócitos. (Fausto N 1993, Fausto N e Mead JE 1989). O HGF se liga ao receptor Met nos hepatócitos e ativa seu crescimento e proliferação. (Borowick et al 2004) HGF, EGF e TGF alfa são potentes mitógenos in vitro, pois podem induzir a proliferação de hepatócitos em um fígado normal mesmo na ausência de outros fatores e na presença de fatores como citocinas, eles podem estimular a proliferação de uma proporção significativa de hepatócitos. (Block GD et al 1996, Webber EM et al 1998) O TGF-α pode induzir a síntese de DNA e a expressão de c-myc quando adicionado à cultura de hepatócitos de rato. (Skouteris GG e Menamin MM 1992) Mediadores inflamatórios como a prostaglandina (PGE-2) também desempenham algum papel na regeneração do fígado, pois seu nível aumenta após hepatectomia em ratos, e esse processo depende do c-AMP; Verificou-se que a adição de prostaglandinas à cultura de hepatócitos aumenta a síntese de DNA. (Tsujii H et al, 1993) EGF pode estimular o hepatócito de rato neonatal em cultura primária a entrar nas fases S e M, que podem ser detectadas em 4 horas e atingem o pico entre 12 a 16 horas depois, ele declina e esse efeito pode ser modulado por fatores séricos e administração de glucagon e insulina amplifica ainda mais o crescimento. (Draghi E et al, 1980) O HGF tem um papel considerável no PHLR, após a ligação ao receptor met ativa o STAT-3 (transdutor de sinal e ativador da transcrição 3) que medeia a indução de genes de resposta precoce e camundongos mutantes Met mostraram regeneração hepática prejudicada .( Borowiak M et al 2004) Huh CG et al em 2004 por seu estudo em camundongos mutantes Met mostraram que a via de sinalização HGF/C-Met desempenha um papel central no desenvolvimento, regeneração hepática e tumorigênese. A via HGF/Met regula a expressão de muitos genes relacionados ao ciclo celular e apoptose, incluindo p53, ciclina E e ciclina B, a fim de promover o ciclo celular e inibir a apoptose nas 24 horas após a hepatectomia parcial. (Paranjpe S et al 2007) STAT-3 (transdutor de sinal e ativador-3) é um fator de transcrição que regula vários genes de resposta de crescimento primário após hepatectomia e pode ser ativado por vários fatores de crescimento e citocinas. (Li W et al 2002) A atividade de ligação do DNA STAT-3 aumenta no fígado remanescente dentro de 30 minutos de HP (hepatectomia parcial) e atinge um pico de 30 vezes dentro de 3 horas e este aumento não ocorre após cirurgia simulada. (Cressman DE et al, 1995) Vários proto-oncogenes também estão envolvidos na iniciação e conclusão da regeneração do fígado, destes c-fos, c-jun e c-myc são genes importantes. Os níveis de transcrição de C-fos e c-jun aumentam no fígado quase imediatamente após a hepatectomia e voltam ao normal em 2 horas. Isto é seguido pela elevação do RNA c-mycm que atinge o pico em 2 horas e desce para o nível basal em 4 horas. (Fausto N et al 1989; Morello D, 1989) Em um estudo posterior, Morello D et al (1990) descobriu que o aumento no c-myc RNA após a hepatectomia é muitas vezes maior do que após a cirurgia simulada.

Além dos fatores mencionados acima, várias células como células ovais, macrófagos, plaquetas e células-tronco (CD133+) também participam direta ou indiretamente do PHLR. (Evarts RP et al 1987, Nakamura T et al 1986, Fausto N 2004, Xiang S et al 2012) Em um estudo de amEsch JS (2012), a infusão de células-tronco CD 133+ melhorou a reserva hepática e o resultado geral após hepatectomia estendida. As células T também podem afetar a regeneração do fígado e camundongos deficientes em células T e linfotoxina diminuíram a capacidade de regeneração do fígado. (Anders SA et al 2005, Tumanov AV et al 2009) As células ovais são menos sensíveis à inibição por TGF-beta, que pode inibir significativamente a proliferação de hepatócitos maduros, de modo que essas células (células ovais) fornecem uma rota alternativa para a regeneração do fígado. (Lenanh NN et al 2007) O TGF beta é um inibidor da proliferação descontrolada de heaptócitos e a expressão do RNAm do TGF beta atinge seu pico próximo à conclusão da divisão celular e da mitose, também tem efeito inibitório na atividade do EGF. (Nquyen LN et al 2007, Braun L et al, 1988, Fausto N et al 1990). Em um estudo de Romero GJ et (2005), camundongos heptectomizados nocauteados para o receptor TGF beta mostraram aumento da proliferação de hepatócitos e aumento da relação entre a massa do fígado e o corpo.

Scotte M et al (1997) estudaram a expressão de citocinas no fígado após hepatectomia menor e maior em ratos e descobriram que TNF e IL-1 aumentam após hepatectomia menor e maior, enquanto a regulação positiva de IL-6 é mais proeminente após hepatectomia maior (80%). Li J et al (2009) comparou o perfil de regeneração após hepatectomia maior (2/3) e menor (1/3) em ratos, perfis de expressão gênica em 4, 12 e 30 horas após a hepatectomia mostraram regulação ascendente e descendente semelhantes, embora alguns genes mostrou expressão preferencial após hepatectomia maior. Masson S et al (1999) também estudaram o impacto da extensão da ressecção na regeneração hepática em ratos e concluíram que a resposta regenerativa ocorre em qualquer extensão da hepatectomia, mas o curso da regeneração e expressão dos fatores de crescimento difere de acordo com o volume do fígado ressecado. M Nagino et al (2011) observaram que o fígado se regenera rapidamente nas primeiras duas semanas após a hepatectomia maior e depois progride lentamente e para quando atinge 3/4 do volume hepático original, o que geralmente ocorre de 6 meses a 1 ano após a hepatectomia. Eles também notaram que fatores como extensão da ressecção, área de superfície corporal, ressecção da veia porta, emobilização da veia porta e depuração do ICG estão associados à regeneração do volume hepático após a hepatectomia.