Studio dei mediatori della rigenerazione epatica post epatectomia

Studio prospettico non randomizzato per studiare l'espressione dei mediatori della rigenerazione epatica post epatectomia (PHLR) e confrontare con un gruppo non epatectomia: uno studio pilota

Contesto: studi sperimentali che utilizzano modelli animali post epatectomia sono stati utilizzati per studiare il meccanismo di rigenerazione del fegato. L'epatectomia per varie malattie e il trapianto di fegato da donatore vivente forniscono un buon modello umano per studiare in vivo il meccanismo di rigenerazione del fegato. Questi studi sono necessari per l'applicazione clinica delle conoscenze ottenute dagli esperimenti sugli animali e guideranno ulteriori ricerche per sviluppare nuove modalità per la gestione dell'insufficienza epatica, della cirrosi e del cancro.

Introduzione :

Il fegato è un organo vitale che svolge varie funzioni metaboliche e protettive necessarie per il mantenimento della vita e ha il potenziale intrinseco di rigenerarsi e ripristinare il volume dopo la sua parziale resezione. La rigenerazione epatica dopo epatectomia avviene principalmente per proliferazione di epatociti maturi (Fausto N 2003 & 2004); cambiamenti nell'emodinamica portale e nelle citochine (IL-6, TNF-α) considerati i più importanti fattori scatenanti di questo processo. (Abhshagen K et al 2012, Scotte M et al 1997) Si propone che l'aumento del flusso di sangue portale al fegato residuo produca lesioni da stress da taglio che portano al rilascio di fattori come NO e VEGF che attivano la cascata di rigenerazione (Marabushi et al 2004). Le citochine (IL-6 e TNF-α), NO e VEGF agiscono sul pro HGF (fattore di crescita degli epatociti inattivo) per convertirlo in HGF attivo che agisce attraverso i recettori Met per attivare ulteriormente STAT-3 che è un mediatore chiave della fase iniziale di PHLR. (Abhshgen K et al 2008, Cresman DE et al 1996, Cressman DE1997, Sudo K et al 2008, Borowicak M et al 2004, Paranjpe S et al 2007). , ormoni pancreatici, endotossine derivate dall'intestino e altri fattori epatotrofici, tutti questi possono agire direttamente per attivare la replicazione del DNA. (Bucher NL et al 1977, Riehle KJ et al 2011) La somministrazione di una miscela di amminoacidi a ratti intatti induce un'ondata di replicazione degli epatociti e la sua privazione blocca il PHLR. (Mead JE et al 1990) Anche l'insulina, il glucagone e l'ormone della crescita hanno un impatto significativo sulla rigenerazione del fegato. (Bucher NLR 1976, Shi min luo et al 2004, Amal ZS et al 2011) La capacità del fegato di rigenerarsi dopo la sua resezione parziale ci permette di eseguire l'epatectomia per trapianto di fegato da donatore vivente, neoplasie epatiche e tumori biliari. L'epatectomia per queste condizioni ci fornisce anche un buon modello per studiare il meccanismo in vivo della rigenerazione del fegato negli esseri umani. Questi studi sono importanti per l'applicazione clinica delle conoscenze ottenute da studi sperimentali su animali post epatectomia. Questi studi ci aiuteranno a conoscere i mediatori delle varie fasi della rigenerazione epatica post epatectomia (PHLR) e guideranno la ricerca futura per sviluppare nuovi approcci per la prevenzione e la gestione delle complicanze post epatectomia potenzialmente letali come la "Sindrome Small for size", l'insufficienza epatica . Questi percorsi aiuteranno a comprendere il controllo in vivo della proliferazione cellulare e potrebbero rivelarsi fondamentali per sviluppare nuovi approcci terapeutici per il trattamento della cirrosi e del cancro.

Ipotesi nulla: l'espressione dei mediatori della rigenerazione epatica post epatectomia (PHLR) non è diversa tra epatectomia (gruppo di studio) e gruppo non epatectomia (gruppo di controllo).

Obiettivo: studiare il meccanismo della rigenerazione epatica post epatectomia (PHLR) e confrontare l'espressione dei mediatori di PHLR tra l'epatectomia (gruppo di studio) e un gruppo non epatectomia (gruppo di controllo).

Obiettivi :

1. Studiare i mediatori di PHLR nel modello umano.
2. Per confrontare l'espressione dei mediatori PHLR tra epatectomia (gruppo di studio) e non epatectomia (gruppo di controllo).
3. Per studiare i cambiamenti iniziali di PHLR nel tessuto epatico. Paziente e metodo: questo percorso prospettico non randomizzato sarà condotto su due gruppi di pazienti: gruppo epatectomia (studio) e gruppo non epatectomia (controllo) e in ciascun gruppo verranno reclutati almeno 10 pazienti adulti consecutivi (18 anni o più) secondo i criteri di inclusione ed esclusione di seguito riportati. Il consenso informato sarà ottenuto dai pazienti in entrambi i gruppi. Il sangue venoso periferico (da una vena dell'avambraccio) (6 ml) verrà raccolto un giorno prima dell'intervento chirurgico e dopo l'intervento chirurgico nei giorni postoperatori 1, 3,7, 14 (2 settimane), 42 (6 settimane) e 180 (6 settimane) mesi). Un piccolo ramo della vena porta verrà incannulato con un catetere endovenoso da 20 gauge per la misurazione della pressione portale e la raccolta del sangue venoso portale (6 ml) all'inizio dell'intervento ma dopo l'ingresso all'interno dell'addome e alla fine dell'intervento ma prima chiusura dell'addome. La raccolta del campione di sangue da una vena periferica (vena dell'avambraccio), la misurazione della pressione portale e la raccolta del sangue portale saranno effettuate in entrambi i gruppi di studio, ma i pazienti nel gruppo di epatectomia (studio) saranno sottoposti a una procedura aggiuntiva, ad esempio trucut (ago) biopsia dal fegato residuo.

Il campione di biopsia epatica sarà conservato in soluzione di formalina e trasferito al laboratorio di patologia per rilevare i cambiamenti iniziali durante PHLR e i loro possibili mediatori, il normale tessuto epatico presente nel campione resecato servirà come autocontrollo. Il sangue della vena periferica e dei piccoli rami della vena porta sarà raccolto in fiale standard utilizzate a tale scopo e trasferito al laboratorio per l'analisi per rilevare i mediatori della rigenerazione epatica. L'analisi del campione di sangue sarà effettuata utilizzando il metodo ELISHA. La misurazione della pressione portale verrà effettuata mediante cannulazione del piccolo ramo della vena porta (ad es. vena gastroepiploica) dopo l'ingresso all'interno della vena questo catetere endovenoso sarà collegato ad un registratore di pressione digitale tramite un tubo di collegamento riempito con soluzione fisiologica. Questo registratore di pressione digitale è disponibile in ciascuna postazione di lavoro per anestesia (Marca: Drager) e di solito fornisce misurazioni in mm Hg, la registrazione della pressione verrà eseguita prima e dopo l'intervento chirurgico per osservare l'effetto dell'intervento chirurgico sulla pressione portale.

Criteri di inclusione: Pazienti adulti (18 anni o più) con neoplasie maligne del tratto gastrointestinale che richiedono resezione parziale del fegato (gruppo di studio) o resezione di altre parti del tratto gastrointestinale (gruppo di controllo) e sono disposti a partecipare allo studio.

Criteri di esclusione- Pazienti che non sono disposti a partecipare allo studio. Pazienti con condizioni che possono influenzare l'espressione del mediatore di PHLR (ad es. immunosoppressione, epatite cronica, cirrosi, ipertensione portale, gravidanza, uso di contraccettivi), i pazienti che risulteranno avere una malattia avanzata o inoperabile durante l'intervento chirurgico saranno esclusi dallo studio e i dati raccolti da loro non saranno inclusi nell'analisi.

Dimensione del campione: minimo 10 pazienti in ciascun gruppo Disegno: percorso prospettico non randomizzato Luogo dello studio: Dipartimento di chirurgia gastrointestinale, GBPH e MAMC, Nuova Delhi Durata: 2 anni. Follow-up: 6 mesi Finanziamento: gli investigatori richiederanno finanziamenti alle agenzie governative. Mediatore di PHLR da analizzare nel sangue periferico con metodo ELISA - IL-1 IL-6, T N F-α, TNF-β, HGF (fattore di crescita degli epatociti), GH (ormone della crescita), Insulina e Glucagone.

Esame del campione di biopsia epatica (Immunoistochimica): indice mitotico ( Ki 67), EPCAM, STAT-3, recettore per HGF, VEGF, NKAM e CD133.

Metodi statistici: tutti i dati verranno inseriti in Microsoft Excel e i calcoli statistici verranno eseguiti utilizzando il software SPSS. Al fine di confrontare le medie dell'espressione di vari fattori tissutali nel tessuto epatico prima e dopo l'epatectomia, i ricercatori devono utilizzare il test t appaiato se la distribuzione delle variabili è normale e il test del rango del segno di Wilcox-on per una distribuzione non normale. Per confrontare l'espressione dei mediatori della rigenerazione epatica nel siero dei pazienti nei gruppi di studio e di controllo, i ricercatori devono utilizzare il test t indipendente per una distribuzione normale e il test di Mann Whitney per una distribuzione non normale. Al fine di studiare le medie dei livelli sierici dei mediatori della rigenerazione epatica in diversi momenti prima e dopo l'intervento chirurgico, i ricercatori devono utilizzare ANOVA per una distribuzione normale e test di Friedman per una distribuzione non normale seguita da test post hoc. Il valore P di 0,5 o inferiore verrà utilizzato per derivare il significato.

Articolo di letteratura:

La rigenerazione del fegato dopo l'epatectomia è un processo molto complesso e ordinato che comporta la proliferazione di epatociti maturi per riguadagnare il volume del fegato, l'esatto meccanismo di rigenerazione del fegato non è stato spiegato fino ad ora ma le evidenze basate sulla ricerca sugli animali (ratto, topo, cane ecc.) indicano che l'acuta cambiamento nell'emodinamica portale, citochine, fattore di crescita (HGF, TGF, EGF), ormoni (come GH, insulina o adrenalina) sono attivamente coinvolti in questo processo controllato da centinaia di geni. (Fausto N 2012 e Michelopoulos 2010) Marabushi et al (2004) hanno proposto che l'aumento acuto della quantità di sangue portale erogato al fegato residuo produca una lesione da stress di taglio che porta alla produzione di ossido nitrico (NO), all'attivazione del canale del calcio e al rilascio di VEGF; tutti svolgono un ruolo chiave nell'avvio del processo di rigenerazione. Bucher NL (1964) ha osservato che i cambiamenti emodinamici nel flusso sanguigno portale sono direttamente correlati all'entità dell'epatectomia, l'aumento della pressione portale dopo il 90% di epatectomia è molto più alto che dopo il 70% di epatectomia. Sato et al (1997 e 1999) hanno riconfermato i risultati di Bucher NL e hanno anche osservato un progressivo aumento della pressione portale con il progredire della rigenerazione epatica e il suo declino verso il suo completamento. Studi sperimentali di vari ricercatori come Wang e Lautt (1998), Cantre D et al (2008,) Schoen JM et al (2001) e Mei Y et al (2011) hanno ulteriormente confermato il ruolo dell'NO nell'attivazione dei fattori responsabili della proliferazione degli epatociti. Il VEGF rilasciato dall'endotelio sinusoidale è una risposta alla lesione da stress da taglio che stimola l'HGF (fattore di crescita degli epatociti) ad agire sui recettori c-met e ad avviare la proliferazione degli epatociti. (Paranjpe S et al 2007, Borowiak M et al 2004) L'ipertensione portale associata alla cirrosi non porta a lesioni associate a stress da taglio dovute alla capillarizzazione delle cellule endoteliali sinusoidali (SEC) e alla perdita delle placche cribrose. (Sato et al 1997 & Vollmer et al 1998).

Suenaga M (1983) ha studiato il ruolo del sangue portale nella rigenerazione epatica dopo epatectomia parziale nei cani e ha notato che per la rigenerazione epatica è necessaria una quantità adeguata di sangue portale e che un'elevata concentrazione di aminoacidi nel sangue portale ha un impatto positivo sul processo di rigenerazione. In un altro studio Skov OP et al (1988) hanno notato che il sangue portale contiene elevate quantità di EGF (fattore di crescita epidermico), ormoni pancreatici (insulina, glucagone) e altri fattori di crescita che partecipano attivamente alla rigenerazione del fegato. Bucher NL (1976 e 1977) ha osservato che l'insulina e il glucagone facilitano entrambi la rigenerazione del fegato e la sintesi del DNA dopo l'epatectomia, ma per questo è necessario un fattore non portale poiché entrambi non sono riusciti a indurre la proliferazione degli epatociti in un fegato intatto, ma possono indurre la proliferazione degli epatociti nei ratti epatectomizzati ed eviscerati. Oltre a questi due (insulina e glucagone), partecipano a questo processo anche altri ormoni come l'ormone della crescita, né l'adrenalina, la serotonina, ecc. (Amal ZS et al, 2011; Shi Min Luo, 2004) IL-6 e TNF-α sono due fattori vitali per l'inizio del PHLR, il sangue portale contiene fattori derivati ​​dall'intestino come lipopolisaccaridi, fattori del complemento e molecole di adesione intercellulare che attivare le cellule di Kupffer per rilasciare IL-6 e TNF-α che agiscono in modo paracrino per avviare la rigenerazione. (Fausto N 2006, Michelopoulos 2007, Cressman DE et al 1996, Feingold KR et al 1988, Sudo K et al 2008, Yamada Y et al 1997, Cornell RP et al 1985). Il-6,TNF-α, VEGF, NO avviano la rigenerazione attivando l'HGF (fattore di crescita degli epatociti) che è un potente mitogeno degli epatociti. (Diaz JJ et al 2011, Cantre D et al 2008, Rai RM et al 2005). L'HGF insieme al fattore di crescita epidermico (EGF), al fattore di crescita dei fibroblasti (FGF), al fattore di crescita trasformante (TGF), agli ormoni epatotrofici e a molti altri fattori noti e sconosciuti controlla la proliferazione e la propagazione degli epatociti. (Fausto N 1993, Fausto N e Mead JE 1989). L'HGF lega il recettore Met sugli epatociti e ne attiva la crescita e la proliferazione. (Borowick et al 2004) HGF, EGF e TGF alfa sono potenti mitogeni in vitro in quanto possono indurre la proliferazione degli epatociti in un fegato normale anche in assenza di altri fattori e in presenza di fattori come le citochine possono stimolare la proliferazione di una percentuale significativa di epatociti. (Block GD et al 1996,Webber EM et al 1998) Il TGF-α può indurre la sintesi del DNA e l'espressione di c-myc se aggiunto alla coltura di epatociti di ratto. (Skouteris GG e Menamin MM 1992) Anche i mediatori dell'infiammazione come la prostaglandina (PGE-2) giocano un ruolo nella rigenerazione del fegato poiché il suo livello aumenta dopo l'epatectomia nei ratti e questo processo dipende dal c-AMP; è stato riscontrato che l'aggiunta di prostaglandine alla coltura di epatociti o aumenta la sintesi del DNA. (Tsujii H et al, 1993) L'EGF può stimolare l'epatocita di ratto neonatale nella coltura primaria a entrare nelle fasi S e M, che possono essere rilevate già dopo 4 ore e picchi tra le 12 e le 16 ore successive, diminuisce e questo effetto può essere modulato da fattori sierici e la somministrazione di glucagone e insulina amplifica ulteriormente la crescita. (Draghi E et al, 1980) L'HGF ha un ruolo considerevole nel PHLR, dopo aver legato il recettore met attiva STAT-3 (trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3) che media l'induzione dei geni di risposta precoce e i topi mutanti Met hanno mostrato una rigenerazione epatica compromessa .( Borowiak M et al 2004) Huh CG et al nel 2004 con il loro studio sui topi mutanti Met hanno dimostrato che la via di segnalazione HGF/C-Met gioca un ruolo centrale nello sviluppo, nella rigenerazione del fegato e nella tumorigenesi. Il percorso HGF/Met regola l'espressione di molti geni correlati al ciclo cellulare e all'apoptosi, tra cui p53, ciclina E e ciclina B, al fine di promuovere il ciclo cellulare e inibire l'apoptosi nelle 24 ore successive all'epatectomia parziale. (Paranjpe S et al 2007) STAT-3 (signal transducer and activator-3) è un fattore di trascrizione che regola vari geni primari di risposta alla crescita dopo epatectomia e può essere attivato da vari fattori di crescita e citochine. (Li W et al 2002) STAT -3 L'attività di legame al DNA aumenta nel fegato residuo entro 30 minuti dall'IP (epatectomia parziale) e raggiunge picchi di 30 volte entro 3 ore e questo aumento non si verifica dopo un intervento chirurgico fittizio. (Cressman DE et al, 1995) Diversi proto-oncogeni sono anche coinvolti nell'inizio e nel completamento della rigenerazione del fegato, di questi c-fos, c-jun e c-myc sono geni importanti. I livelli di trascrizione C-fos e c-jun aumentano nel fegato quasi immediatamente dopo l'epatectomia e tornano alla normalità entro 2 ore. Questo è seguito dall'elevazione dell'RNA c-myc m che raggiunge il picco a 2 ore e scende al livello basale a 4 ore. (Fausto N et al 1989; Morello D, 1989) In un ulteriore studio Morello D et al (1990) hanno scoperto che l'aumento dell'RNA c-myc dopo epatectomia è di molte volte superiore a quello dopo un intervento chirurgico fittizio.

Oltre ai fattori sopra menzionati, anche diverse cellule come la cellula ovale, i macrofagi, le piastrine e le cellule staminali (CD133+) partecipano direttamente o indirettamente al PHLR. (Evarts RP et al 1987, Nakamura T et al 1986, Fausto N 2004, Xiang S et al 2012) In uno studio di amEsch JS (2012) l'infusione di cellule staminali CD 133+ ha migliorato la riserva epatica e l'esito complessivo dopo epatectomia estesa. Le cellule T possono anche influenzare la rigenerazione del fegato e i topi carenti di cellule T e linfotossina hanno una ridotta capacità di rigenerazione del fegato. (Anders SA et al 2005, Tumanov AV et al 2009) Le cellule ovali sono meno sensibili all'inibizione del TGF-beta, che può inibire significativamente la proliferazione degli epatociti maturi, quindi queste cellule (cellule ovali) forniscono una via alternativa per la rigenerazione del fegato. (Lenanh NN et al 2007) Il TGF beta è un inibitore della proliferazione incontrollata degli eaptociti e l'espressione del TGF beta m RNA raggiunge il picco verso il completamento della divisione cellulare e della mitosi, ha anche un effetto inibitorio sull'attività dell'EGF. (Nquyen LN et al 2007, Braun L et al, 1988, Fausto N et al 1990). In uno studio di Romero GJ et (2005) i topi eptectomizzati knockout per il recettore beta del TGF hanno mostrato un aumento della proliferazione degli epatociti e un aumento del rapporto tra massa epatica e corpo.

Scotte M et al (1997) hanno studiato l'espressione delle citochine nel fegato dopo epatectomia minore e maggiore nei ratti e hanno scoperto che TNF e IL-1 aumentano dopo epatectomia minore e maggiore, mentre l'upregolazione di IL-6 è più importante dopo epatectomia maggiore (80%). Li J et al (2009) hanno confrontato il profilo di rigenerazione dopo epatectomia maggiore (2/3) e minore (1/3) nei ratti, i profili di espressione genica a 4, 12 e 30 ore dopo l'epatectomia hanno mostrato una regolazione su e giù simile sebbene alcuni geni ha mostrato un'espressione preferenziale dopo epatectomia maggiore. Masson S et al (1999) hanno anche studiato l'impatto dell'estensione della resezione sulla rigenerazione epatica nei ratti e hanno concluso che la risposta rigenerativa si verifica qualunque sia l'estensione dell'epatectomia, ma il corso della rigenerazione e l'espressione dei fattori di crescita differiscono a seconda del volume del fegato resecato. M Nagino et al (2011) hanno osservato che il fegato si rigenera rapidamente nelle prime due settimane dopo l'epatectomia maggiore e successivamente progredisce lentamente e si ferma quando raggiunge i 3/4 del volume epatico originale, che di solito si verifica da 6 mesi a 1 anno dopo l'epatectomia. Hanno anche notato che fattori come l'estensione della resezione, la superficie corporea, la resezione della vena porta, l'emobilizzazione della vena porta e la clearance dell'ICG sono associati alla rigenerazione del volume epatico dopo l'epatectomia.