Undersøgelse af mediatorer af posthepatektomi leverregenerering

Prospektivt ikke-randomiseret forsøg for at studere ekspression af mediatorer af posthepatektomi leverregenerering (PHLR) og sammenligne med en ikke-hepatektomigruppe: et pilotstudie

Baggrund: Eksperimentelle undersøgelser ved hjælp af dyremodeller efter hepatektomi er blevet brugt til at studere mekanismen for leverregenerering. Hepatektomi for forskellige sygdomme og levende donor levertransplantation giver en god menneskelig model til at studere in vivo mekanisme for leverregenerering. Disse undersøgelser er nødvendige for den kliniske anvendelse af viden opnået ved dyreforsøg og vil guide yderligere forskning for at udvikle nye modaliteter til håndtering af leversvigt, skrumpelever og cancer.

Introduktion :

Leveren er et vitalt organ, der tjener forskellige metaboliske og beskyttende funktioner, der er nødvendige for at opretholde liv, og det har et iboende potentiale til at regenerere og genoprette volumen efter dets delvise resektion. Leverregenerering efter hepatektomi sker hovedsageligt ved proliferation af modne hepatocytter (Fausto N 2003 & 2004); ændringer i portalhæmodyanmik og cytokiner (IL-6, TNF-α) betragtes som de vigtigste triggerfaktorer for denne proces. (Abhshagen K et al 2012, Scotte M et al 1997) Det foreslås, at øget levering af portalblod til restlever producerer forskydningsbelastningsskade, der fører til frigivelse af faktorer som NO og VEGF, som aktiverer regenereringskaskaden (Marabushi et al 2004). Cytokiner (IL-6 og TNF-α), NO og VEGF virker på pro HGF (inaktiv hepatocytvækstfaktor) for at omdanne den til aktiv HGF, som virker gennem Met-receptorer for yderligere at aktivere STAT-3, som er en nøglemediator i den tidlige fase af PHLR. (Abhshgen K et al 2008, Cresman DE et al 1996, Cressman DE1997, Sudo K et al 2008, Borowicak M et al 2004, Paranjpe S et al 2007) Øget levering af portalblod til resterende lever øges også pr. enheds tilgængelighed af aminosyrer. , pancreashormoner, tarmafledte endotoksiner og andre hepatotrofiske faktorer, kan alle disse virke direkte til at aktivere DNA-replikation. (Bucher NL et al 1977, Riehle KJ et al. 2011) Administration af aminosyreblanding til intakte rotter inducerer en bølge af hepatocytreplikation, og dens deprivation blokerer PHLR. (Mead JE et al. 1990) Insulin, glukagon og væksthormon har også en betydelig indflydelse på leverregenerering. (Bucher NLR 1976, Shi min luo et al 2004, Amal ZS et al 2011) Leverens evne til at regenerere efter dens delvise resektion tillader os at udføre hepatektomi for levertransplantation af levende donorer, hepatiske neoplasmer og galdekræft. Hepatektomi for disse tilstande giver os også en god model til at studere in vivo-mekanismen for leverregenerering hos mennesker. Disse undersøgelser er vigtige for den kliniske anvendelse af viden opnået ved eksperimentelle undersøgelser på posthepatektomidyr. Disse undersøgelser vil hjælpe os med at kende mediatorerne af forskellige faser af posthepatektomi leverregenerering (PHLR) og vil guide fremtidig forskning for at udvikle nye tilgange til forebyggelse og håndtering af livstruende posthepatektomi-komplikationer som "Small for size syndrom", leversvigt . Disse spor vil hjælpe med at forstå in vivo kontrol af cellulær spredning og kan vise sig at være afgørende for at udvikle nye terapeutiske tilgange til behandling af skrumpelever og kræft.

Nulhypotese: Ekspression af mediatorer af posthepatektomi leverregenerering (PHLR) er ikke forskellig mellem hepatektomi (undersøgelsesgruppe) og ikke-hepatektomigruppe (kontrolgruppe).

Formål: At studere mekanismen for posthepatektomi leverregenerering (PHLR) og sammenligne ekspression af mediatorer af PHLR mellem hepatektomi (undersøgelsesgruppe) og en ikke-hepatektomigruppe (kontrolgruppe).

Mål:

1. At studere mediatorerne af PHLR i menneskelig model.
2. At sammenligne ekspression af mediatorer PHLR mellem hepatektomi (undersøgelsesgruppe) og ikke-hepatektomi (kontrolgruppe).
3. At studere indledende ændringer af PHLR i levervæv. Patient og metode: Dette prospektive ikke-randomiserede spor vil blive udført på to grupper af patienterne - hepatektomi (undersøgelse) gruppe og ikke-hepatektomi (kontrol) gruppe, og mindst 10 på hinanden følgende voksne (18 år eller mere) patienter vil blive rekrutteret i hver gruppe i henhold til inklusions- og eksklusionskriterier angivet nedenfor. Der vil blive indhentet informeret samtykke fra patienterne i begge grupper. Perifert (fra en underarmsvene) venøst ​​blod (6 ml) vil blive opsamlet en dag før operationen og kl. efter operationen på postoperativ dag 1, 3,7, 14 (2 uger), 42 (6 uger) og 180 (6) måneder). En lille gren af ​​portalvenen vil blive kanyleret med et 20 gauge intravenøst ​​kateter til måling af portaltryk og opsamling af portalvenøst ​​blod (6 ml) ved starten af ​​operationen, men efter indgangen i maven og ved slutningen af ​​operationen, men før lukning af maven. Indsamling af blodprøven fra en perifer vene (underarmsvene), måling af portaltryk og indsamling af portalblod vil blive udført i begge undersøgelsesgrupper, men patienter i hepatektomi (undersøgelses) gruppen vil gennemgå en yderligere procedure, dvs. trucut (nål) biopsi fra den resterende lever.

Leverbiopsiprøver vil blive konserveret i formalinopløsning og overført til patologilaboratoriet for at detektere indledende ændringer under PHLR og deres mulige mediatorer, normalt levervæv til stede i resekeret prøve vil tjene som selvkontrol. Blod fra perifer vene og små grene af portvenen vil blive opsamlet i standard hætteglas, der anvendes til dette formål, og overføres til laboratoriet til analyse for at påvise mediatorer af leverregenerering. Analysen af ​​blodprøven vil blive udført ved hjælp af ELISHA-metoden. Måling af portaltrykket vil blive udført ved kanulering af en lille gren af ​​portalvenen (f.eks. Gastro epiploisk vene) efter indgangen i venen vil dette intravenøse kateter blive forbundet til en digital trykoptager via et forbindelsesrør fyldt med normalt saltvand. Denne digitale trykoptager er tilgængelig i hver af anæstesiarbejdspladserne (Make: Drager), og den giver normalt mål i mm Hg, trykregistreringen vil blive foretaget før og efter operationen for at observere effekten af ​​operation på portaltrykket.

Inklusionskriterier: Voksne patienter (18 år eller mere) med ondartede neoplasmer i mave-tarmkanalen, som kræver enten delvis resektion af lever (undersøgelsesgruppe) eller resektion af andre dele af mave-tarmkanalen (kontrolgruppe) og er villige til at deltage i undersøgelsen.

Eksklusionskriterier- Patienter, der ikke er villige til at deltage i undersøgelsen. Patienter med tilstande, som kan påvirke ekspression af mediator af PHLR (f.eks. immunsuppression, kronisk hepatitis, cirrhose, portal hypertension, graviditet, brug af prævention), vil patienter, som viser sig at have en fremskreden eller inoperabel sygdom under operationen, blive udelukket fra undersøgelsen, og data indsamlet fra dem vil ikke blive inkluderet i analysen.

Prøvestørrelse: Minimum 10 patienter i hver gruppe Design: prospektivt ikke-randomiseret spor Studiested: Afdeling for Gastrointestinal kirurgi, GBPH og MAMC, New Delhi Varighed: 2 år. Opfølgning: 6 måneder Finansiering: Efterforskerne vil ansøge om støtte fra de offentlige myndigheder. Mediator af PHLR, der skal analyseres i perifert blod ved ELISA-metoden - IL-1 IL-6, TN F-α, TNF-β, HGF (hepatocytvækstfaktor), GH (væksthormon), Insulin og Glucagon.

Undersøgelse af leverbiopsiprøve (Immunohistokemi): mitotisk indeks (Ki 67), EPCAM, STAT-3, receptor for HGF, VEGF, NKAM og CD133.

Statistiske metoder: Alle data vil blive indtastet i Microsoft excel, og statistiske beregninger vil blive udført ved hjælp af SPSS-software. For at sammenligne midlerne for ekspressionen af ​​forskellige vævsfaktorer i levervæv før og efter hepatektomi skal investigatorerne bruge parret t-test, hvis fordelingen af ​​variabler er normal, og Wilcox-on-tegn rang-test for en ikke-normal fordeling. For at sammenligne ekspressionen af ​​mediatorer for leverregenerering i serum fra patienter i undersøgelses- og kontrolgrupper skal undersøgerne bruge uafhængig t-test for en normalfordeling og Mann Whitney-test for en ikke-normalfordeling. For at studere gennemsnittet af serumniveauer af mediatorer af leverregenerering på forskellige tidspunkter før og efter operationen skal investigatorerne bruge ANOVA til en normalfordeling og Friedman-test for en ikke-normal fordeling efterfulgt af post hoc-test. P-værdi på 0,5 eller derunder vil blive brugt til at udlede signifikans.

Litteraturanmeldelse:

Leverregenerering efter hepatektomi er en meget kompleks og velordnet proces, som involverer proliferation af modne hepatocytter for at genvinde levervolumen, den nøjagtige mekanisme for leverregenerering er ikke blevet udfoldet indtil nu, men beviser baseret på dyreforskning (rotter, mus, hund osv.) indikerer, at akut ændring i portalhæmodynamik, cytokiner, vækstfaktor (HGF,TGF,EGF), hormoner (som GH, insulin eller adrenalin) er aktivt involveret i denne proces, som styres af hundredvis af gener. (Fausto N 2012 og Michelopoulos 2010) Marabushi et al (2004) foreslog, at akut stigning i mængden af ​​portalblodtilførsel til den resterende lever producerer en forskydningsbelastningsskade, som fører til produktion af nitrogenoxid (NO), aktivering af calciumkanal og frigivelse af VEGF; alle spiller en nøglerolle i initieringen af ​​regenereringsprocessen. Bucher NL (1964) observerede, at hæmodynamiske ændringer i portal blodgennemstrømning er direkte relateret til omfanget af hepatektomi, stigning i portaltryk efter 90 % hepatektomi er meget højere end efter 70 % hepatektomi. Sato et al (1997&1999) bekræftede resultaterne af Bucher NL og observerede også en progressiv stigning i portaltrykket, efterhånden som leverregenereringen skrider frem og dens fald hen imod dens afslutning. Eksperimentelle undersøgelser af forskellige forskere som Wang og Lautt (1998), Cantre D et al (2008), Schoen JM et al (2001) og Mei Y et al (2011) bekræftede yderligere NO's rolle i aktiveringen af ​​faktorer, der er ansvarlige for hepatocytproliferation. VEGF frigivet fra sinusformet endotel er respons på forskydningsstressskade stimulerer HGF (hepatocytvækstfaktor) til at virke på c-met-receptorer og initiere hepatocytproliferation. (Paranjpe S et al 2007, Borowiak M et al 2004) Portal hypertension forbundet med skrumpelever fører ikke til forskydningsstress-associeret skade på grund af kapillarisering af sinusformede endotelceller (SEC'er) og tab af sigteplader. (Sato et al 1997 & Vollmer et al 1998).

Suenaga M (1983) undersøgte portalblodets rolle i leverregenerering efter delvis hepatektomi hos hunde og bemærkede, at tilstrækkelig mængde portalblod er nødvendig for hepatisk regenerering, og høj koncentration af aminosyrer i portalblodet har en positiv indvirkning på regenereringsprocessen. I en anden undersøgelse bemærkede Skov OP et al (1988), at portalblod indeholder høje mængder af EGF (epidermal vækstfaktor), pancreashormoner (insulin, glucagon) og andre vækstfaktorer, som deltager aktivt i leverregenerering. Bucher NL (1976 og 1977) observerede, at insulin og glukagon begge letter leverregenerering og DNA-syntese efter hepatektomi, men der kræves en eller anden ikke-portal faktor til dette, da de begge ikke formåede at inducere hepatocytproliferation i en intakt lever, men de kan inducere hepatocytproliferation hos hepatektomiserede og eviscererede rotter. Ud over disse to (insulin og glukagon) deltager også andre hormoner som væksthormon, Nor adrenalin, serotonin osv. i denne proces. (Amal ZS et al, 2011; Shi Min Luo, 2004) IL-6 og TNF-α er to faktorer, som er afgørende for initieringen af ​​PHLR, portalblod indeholder tarmafledte faktorer som lipopolysaccharider, komplementfaktorer og intercellulære adhæsionsmolekyler, som aktiverer Kupffer-celler for at frigive IL-6 og TNF-α, som virker på parakrin måde for at initiere regenerering.(Fausto N 2006, Michelopoulos 2007, Cressman DE et al 1996, Feingold KR et al 1988, Sudo K et al 2008, Yamada Y et al 1997, Cornell RP et al 1985). Il-6,TNF-α, VEGF, NO initierer regenerering ved at aktivere HGF (hepatocytvækstfaktor), som er et potent hepatocytmitogen. (Diaz JJ et al 2011, Cantre D et al 2008, Rai RM et al 2005). HGF sammen med epidermal vækstfaktor (EGF), fibroblast vækstfaktor (FGF), transformerende vækstfaktor (TGF), hepatotrofiske hormoner og flere andre kendte og ukendte faktorer kontrollerer hepatocytproliferation og -formering. (Fausto N 1993, Fausto N og Mead JE 1989). HGF binder Met-receptoren på hepatocytter og aktiverer deres vækst og spredning.(Borowick et al 2004) HGF, EGF og TGF alfa er potente in vitro mitogener, da de kan inducere hepatocytproliferation i en normal lever, selv i fravær af andre faktorer, og i nærvær af faktorer som cytokiner kan de stimulere proliferation en betydelig del af hepatocytter. (Blok GD et al. 1996, Webber EM et al. 1998) TGF-a kan inducere DNA-syntese og c-myc-ekspression, når det tilsættes til rottehepatocytkultur. (Skouteris GG og Menamin MM 1992) Inflammatoriske mediatorer som Prostaglandin (PGE-2) spiller også en vis rolle i leverregenerering, da niveauet stiger efter hepatektomi hos rotter, og denne proces er afhængig af c-AMP; tilsætning af prostaglandiner til hepatocytkultur har vist sig at øge DNA-syntesen. (Tsujii H et al, 1993) EGF kan stimulere neonatal rottehepatocyt i primær kultur til at gå ind i S- og M-faser, som kan påvises så tidligt som 4 timer og toppe mellem 12 til 16 timer derefter, og denne effekt kan moduleres. ved serumfaktorer og administration af glucagon og insulin forstærker væksten yderligere. (Draghi E et al, 1980) HGF har en betydelig rolle i PHLR, efter binding af met-receptor aktiverer den STAT-3 (signaltransducer og aktivator af transkription 3), som medierer induktion af tidlige responsgener, og Met-mutantmus har vist nedsat leverregenerering .( Borowiak M et al 2004) Huh CG et al i 2004 viste ved deres undersøgelse af Met mutante mus, at HGF/C-Met signalvej spiller en central rolle i udvikling, leverregenerering og tumorgenese. HGF/Met pathway regulerer ekspression af mange gener relateret til cellecyklus og apoptose, herunder p53, cyclin E og cyclin B, for at fremme cellecyklus og hæmme apoptose i 24 timer efter delvis hepatektomi. (Paranjpe S et al 2007) STAT-3 (signaltransducer og aktivator-3) er en transkriptionsfaktor, som regulerer forskellige primære vækstresponsgener efter hepatektomi, og den kan aktiveres af forskellige vækstfaktorer og cytokiner.(Li W et al 2002) STAT-3 DNA-bindingsaktivitet stiger i restlever inden for 30 minutter efter PH (partiel hepatektomi) og topper til 30 gange inden for 3 timer, og denne stigning forekommer ikke efter sham-kirurgi. (Cressman DE et al, 1995) Adskillige proto-onkogener er også involveret i initiering og afslutning af leverregenerering, ud af disse c-fos er c-jun og c-myc vigtige gener. C-fos og c-jun transkriptniveauer stiger i leveren næsten umiddelbart efter hepatektomi og vender tilbage til normal efter 2 timer. Dette efterfølges af forhøjelse af c-myc m RNA'et, som når til top efter 2 timer og falder til basal niveau efter 4 timer. (Fausto N et al 1989; Morello D, 1989) I en yderligere undersøgelse fandt Morello D et al (1990), at stigningen i c-myc RNA efter hepatektomi er mange gange højere end efter simuleret operation.

Ud over ovennævnte faktorer deltager adskillige celler som ovale celler, makrofager, blodplader og stamceller (CD133+) også i PHLR direkte eller indirekte.(Evarts RP et al 1987, Nakamura T et al 1986, Fausto N 2004, Xiang S et al 2012) I en undersøgelse af amEsch JS (2012) forbedrede CD 133+ stamceller infusion leverreserven og det samlede resultat efter forlænget hepatektomi. T-celler kan også påvirke leverregenerering, og mus med mangel på T-celler og lymfotoksin har nedsat evne til leverregenerering. (Anders SA et al 2005, Tumanov AV et al 2009) Ovale celler er mindre følsomme hæmning af TGF-beta, som signifikant kan hæmme proliferation modne hepatocytter, så disse celler (ovale celler) giver en alternativ vej til leverregenerering. (Lenanh NN et al 2007) TGF beta er en hæmmer af ukontrolleret heaptocytproliferation og TGF beta m RNA-ekspression når på toppen mod afslutningen af ​​celledeling og mitose, det har også hæmmende effekt på EGF-aktivitet. (Nquyen LN et al 2007, Braun L et al, 1988, Fausto N et al 1990). I en undersøgelse af Romero GJ et (2005) viste TGF beta-receptor knockout heptektomiserede mus øget hepatocytproliferation og øget levermasse til kropsforhold.

Scotte M et al (1997) undersøgte cytokinekspression i leveren efter mindre og større hepatektomi hos rotter og fandt, at TNF og IL-1 stiger efter mindre og større hepatektomi, mens IL-6 up-regulering er mere fremtrædende efter større (80 %) hepatektomi. Li J et al (2009) sammenlignede regenereringsprofil efter større (2/3) og mindre (1/3) hepatektomi hos rotter, genekspressionsprofiler 4, 12 og 30 timer efter hepatektomi viste lignende op- og nedregulering, selvom nogle gener viste præferenceekspression efter større hepatektomi. Masson S et al (1999) undersøgte også indvirkningen af ​​omfanget af resektion på leverregenerering hos rotter og konkluderede, at regenerativ respons forekommer uanset omfanget af hepatektomi, men forløbet af regenerering og ekspression af vækstfaktorer varierer afhængigt af volumen af ​​resektioneret lever. M Nagino et al (2011) observerede, at leveren regenererer hurtigt i de første to uger efter større hepatektomi, og derefter skrider den langsomt frem og stopper, når den når 3/4 af det oprindelige levervolumen, hvilket normalt forekommer 6 måneder til 1 år efter hepatektomien. De bemærkede også, at faktorer som omfanget af resektion, kropsoverfladeareal, portalveneresektion, portalvenemobilisering og ICG-clearance er forbundet med regenererende levervolumen efter hepatektomien.