Tutkimus hepatektomian jälkeisen maksan regeneraation välittäjistä

Tuleva ei-satunnaistettu tutkimus hepatektomian jälkeisen maksan regeneraation (PHLR) välittäjien ilmentymisen tutkimiseksi ja vertailua ei-hepatektomian ryhmään: pilottitutkimus

Taustaa: Kokeellisia tutkimuksia, joissa on käytetty maksan poiston jälkeisiä eläinmalleja, on käytetty maksan regeneraatiomekanismin tutkimiseen. Eri sairauksien hepatektomia ja elävän luovuttajan maksansiirto tarjoavat hyvän ihmismallin maksan uudistumisen in vivo -mekanismin tutkimiseen. Nämä tutkimukset ovat välttämättömiä eläinkokeista saadun tiedon kliinisen soveltamisen kannalta ja ohjaavat jatkotutkimusta uusien menetelmien kehittämiseksi maksan vajaatoiminnan, kirroosin ja syövän hoitoon.

Esittely:

Maksa on elintärkeä elin, joka palvelee erilaisia ​​elämän ylläpitämiseen tarvittavia aineenvaihdunta- ja suojatoimintoja ja sillä on luontainen potentiaali uudistua ja palauttaa tilavuutta osittaisen resektion jälkeen. Maksan uusiutuminen hepatektomian jälkeen tapahtuu pääasiassa kypsien hepatosyyttien lisääntymisen kautta (Fausto N 2003 & 2004); portaalin hemodyanmian ja sytokiinien (IL-6, TNF-α) muutokset, joita pidettiin tämän prosessin tärkeimpinä laukaisutekijöinä. (Abhshagen K et al 2012, Scotte M et al 1997) On ehdotettu, että portaaliveren lisääntynyt kulkeutuminen jäännösmaksaan aiheuttaa leikkausjännitysvaurion, joka johtaa sellaisten tekijöiden, kuten NO ja VEGF, vapautumiseen, jotka aktivoivat regeneraatiokaskadin (Marabushi et al 2004). Sytokiinit (IL-6 ja TNF-α), NO ja VEGF vaikuttavat pro-HGF:ään (inaktiivinen hepatosyyttien kasvutekijä) muuntaakseen sen aktiiviseksi HGF:ksi, joka toimii Met-reseptorien kautta ja aktivoi edelleen STAT-3:a, joka on keskeinen välittäjänä varhaisessa vaiheessa. PHLR. (Abhshgen K et al 2008, Cresman DE et al 1996, Cressman DE1997, Sudo K et al 2008, Borowicak M et al 2004, Paranjpe S et al 2007) Portaaliveren lisääntynyt kulkeutuminen jäljellä olevaan maksan aminohappoon lisää myös saatavuutta yksikköä kohti , haimahormonit, suolistosta peräisin olevat endotoksiinit ja muut hepatotrofiset tekijät, kaikki nämä voivat toimia suoraan aktivoiden DNA:n replikaation. (Bucher NL et al 1977, Riehle KJ et al 2011) Aminohapposeoksen antaminen koskemattomille rotille indusoi hepatosyyttien replikaation aallon, ja sen puute estää PHLR:n. (Mead JE et al 1990) Insuliinilla, glukagonilla ja kasvuhormonilla on myös merkittävä vaikutus maksan uusiutumiseen. (Bucher NLR 1976, Shi min luo ym. 2004, Amal ZS et al 2011) Maksan kyky uusiutua osittaisen resektion jälkeen mahdollistaa hepatektomian suorittamisen elävän luovuttajan maksansiirron, maksakasvaimien ja sappisyöpien yhteydessä. Näiden sairauksien maksan poisto tarjoaa meille myös hyvän mallin ihmisen maksan uudistumisen in vivo -mekanismin tutkimiseen. Nämä tutkimukset ovat tärkeitä hepatektomian jälkeisillä eläimillä tehdyissä kokeellisissa tutkimuksissa saadun tiedon kliinisen soveltamisen kannalta. Nämä tutkimukset auttavat meitä tuntemaan maksan poiston jälkeisen maksan regeneraation (PHLR) eri vaiheiden välittäjät ja ohjaavat tulevaa tutkimusta kehittämään uusia lähestymistapoja hengenvaarallisten hepatektomian jälkeisten komplikaatioiden, kuten "pienen kokoisen oireyhtymän" ja maksan vajaatoiminnan ehkäisyyn ja hoitoon. . Nämä reitit auttavat ymmärtämään solujen lisääntymisen in vivo hallintaa ja voivat osoittautua elintärkeiksi kehitettäessä uusia terapeuttisia lähestymistapoja kirroosin ja syövän hoitoon.

Nollahypoteesi: Hepatektomian jälkeisen maksan regeneraation (PHLR) välittäjien ilmentyminen ei eroa hepatektomian (tutkimusryhmä) ja ei-hepatektomiaryhmän (verrokkiryhmä) välillä.

Tavoite: Tutkia hepatektomian jälkeisen maksan regeneraation (PHLR) mekanismia ja vertailla PHLR:n välittäjien ilmentymistä hepatektomian (tutkimusryhmä) ja ei-hepatektomiaryhmän (verrokkiryhmä) välillä.

Tavoitteet:

1. Tutkia PHLR:n välittäjiä ihmismallissa.
2. Vertaa välittäjäaineiden PHLR ilmentymistä hepatektomian (tutkimusryhmä) ja ei-hepatektomian (kontrolliryhmä) välillä.
3. Tutkia PHLR:n alkumuutoksia maksakudoksessa. Potilas ja menetelmä: Tämä prospektiivinen ei-satunnaistettu polku suoritetaan kahdelle potilasryhmälle - hepatektomia (tutkimus) ryhmä ja ei-hepatektomia (kontrolli) ryhmä, ja vähintään 10 peräkkäistä aikuista (18 vuotta tai enemmän) potilasta rekrytoidaan kuhunkin ryhmään. alla annettujen mukaanotto- ja poissulkemiskriteerien mukaisesti. Molempien ryhmien potilailta hankitaan tietoinen suostumus. Perifeerinen (kyynärvarren laskimoveri) (6 ml) kerätään päivää ennen leikkausta ja leikkauksen jälkeen leikkauksen jälkeisinä päivinä 1, 3, 7, 14 (2 viikkoa), 42 (6 viikkoa) ja 180 (6) kuukaudet). Pienelle porttilaskimon haaralle kanyloidaan 20 gaugen suonensisäinen katetri portaalipaineen mittaamiseksi ja portaalilaskimoveren (6 ml) keräämiseksi leikkauksen alussa, mutta vatsan sisäänmenon jälkeen ja leikkauksen lopussa, mutta ennen vatsan sulkeminen. Verinäytteen otto ääreislaskimosta (kyynärvarren laskimo), portaalipaineen mittaus ja portaaliveren kerääminen tehdään molemmissa tutkimusryhmissä, mutta hepatektomia (tutkimus) -ryhmän potilaille tehdään lisämenettely eli trucut (neula) biopsia maksan jäännöksestä.

Maksakoepalanäyte säilytetään formaliiniliuoksessa ja siirretään patologian laboratorioon PHLR:n aikana tapahtuvien alkumuutosten ja niiden mahdollisten välittäjien havaitsemiseksi. Resektoidussa näytteessä oleva normaali maksakudos toimii itsekontrollina. Veri ääreislaskimosta ja porttilaskimon pienistä haaroista kerätään tähän tarkoitukseen käytettävään standardipulloon ja siirretään laboratorioon analysoitavaksi maksan regeneraation välittäjien havaitsemiseksi. Verinäytteen analyysi tehdään ELISHA-menetelmällä. Portaalipaineen mittaus tehdään kanuloimalla porttilaskimon pieni haara (esim. Gastroepiploinen laskimo) laskimon sisäänmenon jälkeen tämä suonensisäinen katetri liitetään digitaaliseen paineentallentimeen liitäntäputken kautta, joka on täytetty normaalilla suolaliuoksella. Tämä digitaalinen painetallennin on saatavilla jokaisella anestesiatyöasemalla (merkki: Drager) ja se antaa yleensä mittauksen mm Hg:ssä, paineen tallennus tehdään ennen leikkausta ja sen jälkeen, jotta voidaan tarkkailla leikkauksen vaikutusta portaalipaineeseen.

Osallistumiskriteerit: Aikuiset potilaat (vähintään 18-vuotiaat), joilla on maha-suolikanavan pahanlaatuisia kasvaimia, jotka edellyttävät joko maksan osittaista resektiota (tutkimusryhmä) tai muiden maha-suolikanavan osien resektiota (verrokkiryhmä), ja jotka ovat valmiita osallistumaan tutkimukseen.

Poissulkemiskriteerit – Potilaat, jotka eivät ole halukkaita osallistumaan tutkimukseen. Potilaat, joilla on tiloja, jotka voivat vaikuttaa PHLR:n välittäjän ilmentymiseen (esim. immunosuppressio, krooninen hepatiitti, kirroosi, portaalihypertensio, raskaus, ehkäisyvälineiden käyttö), potilaat, joilla todetaan leikkauksen aikana edenneitä tai leikkauskelvottomia tauteja, suljetaan pois tutkimuksesta, eikä heiltä kerättyjä tietoja oteta mukaan analyysiin.

Otoskoko: Vähintään 10 potilasta kussakin ryhmässä Suunnittelu: prospektiivinen ei-satunnaistettu reitti Tutkimuspaikka: Gastrointestinaalkirurgian osasto, GBPH ja MAMC, New Delhi Kesto: 2 vuotta. Seuranta: 6 kuukautta Rahoitus: Tutkijat hakevat rahoitusta valtion virastoilta. Ääreisverestä ELISA-menetelmällä analysoitava PHLR:n välittäjä - IL-1 IL-6, T N F-α, TNF-β, HGF (hepatosyyttien kasvutekijä), GH (kasvuhormoni), insuliini ja glukagoni.

Maksan biopsianäytteen tutkiminen (immunohistokemia): mitoottinen indeksi (Ki 67), EPCAM, STAT-3, HGF-, VEGF-, NKAM- ja CD133-reseptori.

Tilastolliset menetelmät: Kaikki tiedot syötetään Microsoft exceliin ja tilastolaskelmat suoritetaan SPSS-ohjelmistolla. Vertaakseen eri kudostekijöiden ilmentymisen keskiarvoja maksakudoksessa ennen ja jälkeen hepatektomian tutkijoiden on käytettävä parillista t-testiä, jos muuttujien jakauma on normaali, ja Wilcox-on-merkkiarvotestiä epänormaalin jakauman tapauksessa. Vertaakseen maksan regeneraation välittäjien ilmentymistä tutkimus- ja kontrolliryhmien potilaiden seerumissa tutkijoiden on käytettävä riippumatonta t-testiä normaalijakaumaa varten ja Mann Whitney -testiä ei-normaalijakauman määrittämiseksi. Maksan regeneraation välittäjien seerumipitoisuuksien keskiarvojen tutkimiseksi eri ajankohtina ennen leikkausta ja sen jälkeen tutkijoiden on käytettävä ANOVAa normaalijakaumaan ja Friedman-testiä ei-normaalijakaumaan, mitä seuraa post hoc -testi. P-arvoa 0,5 tai pienempi käytetään merkitsevyyden johtamiseen.

Kirjallisuusarvostelu:

Maksan regeneraatio hepatektomian jälkeen on erittäin monimutkainen ja säännöllinen prosessi, johon liittyy kypsien hepatosyyttien lisääntyminen maksan tilavuuden palauttamiseksi. Maksan uusiutumisen tarkkaa mekanismia ei ole toistaiseksi selvitetty, mutta eläintutkimuksiin (rotta, hiiri, koira jne.) perustuvat todisteet osoittavat, että akuutti Muutokset portaalin hemodynamiikassa, sytokiinit, kasvutekijä (HGF,TGF,EGF), hormonit (kuten GH, insuliini tai adrenaliini) ovat aktiivisesti mukana tässä prosessissa, jota säätelevät sadat geenit. (Fausto N 2012 ja Michelopoulos 2010) Marabushi et al (2004) ehdottivat, että akuutti lisääntynyt portaaliveren määrä jäännösmaksaan aiheuttaa leikkausjännitysvaurion, joka johtaa typpioksidin (NO) tuotantoon, kalsiumkanavan aktivoitumiseen ja vapautumiseen. VEGF:stä; niillä kaikilla on keskeinen rooli regeneraatioprosessin käynnistämisessä. Bucher NL (1964) havaitsi, että hemodynaamiset muutokset portaalin verenvirtauksessa liittyvät suoraan hepatektomian laajuuteen, portaalin paineen nousu 90 % hepatektomian jälkeen on paljon suurempi kuin 70 % hepatektomian jälkeen. Sato et al (1997 & 1999) vahvistivat Bucher NL:n havainnot ja havaitsivat myös portaalipaineen asteittaisen nousun maksan regeneraation edetessä ja sen vähenemisen kohti sen päättymistä. Erilaisten tutkijoiden, kuten Wangin ja Lauttin (1998), Cantre D et al (2008,) Schoen JM et al (2001) ja Mei Y et al (2011) kokeelliset tutkimukset vahvistivat edelleen NO:n roolin hepatosyyttien lisääntymisestä vastuussa olevien tekijöiden aktivoinnissa. Sinimuotoisesta endoteelistä vapautuva VEGF on vaste leikkausjännitysvauriolle, joka stimuloi HGF:ää (hepatosyyttien kasvutekijä) vaikuttamaan c-met-reseptoreihin ja käynnistämään hepatosyyttien lisääntymisen. (Paranjpe S et al 2007, Borowiak M et al 2004) Kirroosiin liittyvä portaalihypertensio ei johda leikkausjännitykseen liittyvään vammaan, joka johtuu sinimuotoisten endoteelisolujen (SEC) kapillarisoitumisesta ja seulalevyjen katoamisesta. (Sato et ai. 1997 & Vollmer et ai. 1998).

Suenaga M (1983) tutki portaaliveren roolia maksan regeneraatiossa osittaisen hepatektomian jälkeen koirilla ja huomasi, että riittävä määrä portaaliverta tarvitaan maksan regeneraatioon ja portaaliveren korkealla aminohappopitoisuudella on positiivinen vaikutus regeneraatioprosessiin. Toisessa tutkimuksessa Skov OP et al (1988) totesivat, että portaaliveri sisältää suuren määrän EGF:ää (epidermaalista kasvutekijää), haimahormoneja (insuliini, glukagoni) ja muita kasvutekijöitä, jotka osallistuvat aktiivisesti maksan uudistumiseen. Bucher NL (1976 ja 1977) havaitsi, että insuliini ja glukagoni helpottavat maksan regeneraatiota ja DNA-synteesiä hepatektomian jälkeen, mutta tähän tarvitaan jokin ei-portaalitekijä, koska kumpikaan ei onnistunut indusoimaan hepatosyyttien proliferaatiota ehjässä maksassa, mutta ne voivat indusoida hepatosyyttien proliferaatiota. rotilla, joista on poistettu maksa ja joista on poistettu sisäelimet. Näiden kahden (insuliini ja glukagoni) lisäksi tähän prosessiin osallistuvat myös muut hormonit, kuten kasvuhormoni, ei adrenaliini, serotoniini jne. (Amal ZS et al, 2011; Shi Min Luo, 2004) IL-6 ja TNF-α ovat kaksi tekijää, jotka ovat elintärkeitä PHLR:n käynnistymiselle. Portaaliveri sisältää suolistosta peräisin olevia tekijöitä, kuten lipopolysakkarideja, komplementtitekijöitä ja solujen välisiä adheesiomolekyylejä, jotka aktivoi Kupffer-solut vapauttamaan IL-6:ta ja TNF-α:aa, jotka toimivat parakriinisesti käynnistäen regeneraation (Fausto). N 2006, Michelopoulos 2007, Cressman DE et al 1996, Feingold KR et al 1988, Sudo K et al 2008, Yamada Y et al 1997, Cornell RP et al 1985). IL-6, TNF-a, VEGF, NO käynnistävät regeneraation aktivoimalla HGF:ää (hepatosyyttien kasvutekijä), joka on tehokas hepatosyyttimitogeeni. (Diaz JJ et al 2011, Cantre D et al 2008, Rai RM et al 2005). HGF yhdessä epidermaalisen kasvutekijän (EGF), fibroblastien kasvutekijän (FGF), transformoivan kasvutekijän (TGF), hepatotrofisten hormonien ja useiden muiden tunnettujen ja tuntemattomien tekijöiden kanssa säätelee hepatosyyttien lisääntymistä ja lisääntymistä. (Fausto N 1993, Fausto N ja Mead JE 1989). HGF sitoo Met-reseptoria hepatosyyteissä ja aktivoi niiden kasvua ja lisääntymistä. (Borowick) et al 2004) HGF, EGF ja TGF alfa ovat tehokkaita in vitro mitogeenejä, koska ne voivat indusoida hepatosyyttien proliferaatiota normaalissa maksassa jopa muiden tekijöiden puuttuessa ja tekijöiden, kuten sytokiinien, läsnä ollessa ne voivat stimuloida merkittävän osan maksasoluista lisääntymistä. (Block GD et ai. 1996, Webber EM et ai. 1998) TGF-a voi indusoida DNA-synteesiä ja c-myc-ilmentymistä, kun sitä lisätään rotan hepatosyyttiviljelmään. (Skouteris GG ja Menamin MM 1992) Tulehduksellisilla välittäjäaineilla, kuten prostaglandiinilla (PGE-2), on myös jokin rooli maksan regeneraatiossa, kun sen taso nousee hepatektomian jälkeen rotilla, ja tämä prosessi on riippuvainen c-AMP:stä; prostaglandiinien lisäämisen hepatosyyttiviljelmään on havaittu lisäävän DNA-synteesiä. (Tsujii H et al, 1993) EGF voi stimuloida vastasyntyneen rotan maksasoluja primaariviljelmässä siirtymään S- ja M-vaiheisiin, jotka voidaan havaita jo 4 tunnin kuluttua ja saavuttavat huippunsa 12-16 tunnin kuluttua sen jälkeen, ja tämä vaikutus voidaan moduloida. seerumitekijöiden vaikutuksesta ja glukagonin ja insuliinin antaminen voimistaa kasvua edelleen. (Draghi E et al, 1980) HGF:llä on huomattava rooli PHLR:ssä, kun se on sitoutunut met-reseptoriin, se aktivoi STAT-3:n (signaalimuunnin ja transkription 3 aktivaattori), joka välittää varhaisen vasteen geenien induktiota, ja Met-mutanttihiiret ovat osoittaneet heikentynyttä maksan regeneraatiota .( Borowiak M et al 2004) Huh CG ym. vuonna 2004 Met-mutanttihiirillä tehdyssä tutkimuksessaan osoittivat, että HGF/C-Met-signalointireitillä on keskeinen rooli kehityksessä, maksan regeneraatiossa ja kasvainten muodostumisessa. HGF/Met-reitti säätelee monien solusykliin ja apoptoosiin liittyvien geenien, mukaan lukien p53:n, sykliini E:n ja sykliini B:n, ilmentymistä solusyklin edistämiseksi ja apoptoosin estämiseksi 24 tunnin aikana osittaisen hepatektomian jälkeen. (Paranjpe S et al 2007) STAT-3 (signaalimuunnin ja aktivaattori-3) on transkriptiotekijä, joka säätelee erilaisia ​​primaarisia kasvuvastegeenejä hepatektomian jälkeen, ja se voidaan aktivoida erilaisten kasvutekijöiden ja sytokiinien vaikutuksesta. W et al 2002) STAT-3 DNA:n sitoutumisaktiivisuus kasvaa jäännösmaksassa 30 minuutin sisällä PH:sta (osittaisesta hepatektomiasta) ja saavuttaa huippunsa 30-kertaiseksi 3 tunnin sisällä, eikä tätä kasvua tapahdu valeleikkauksen jälkeen. (Cressman DE et al, 1995) Useat proto-onkogeenit ovat myös mukana maksan regeneraation aloittamisessa ja loppuunsaattamisessa, näistä c-fos, c-jun ja c-myc ovat tärkeitä geenejä. C-fos- ja c-jun-transkriptiotasot nousevat maksassa lähes välittömästi hepatektomian jälkeen ja palautuvat normaaliksi 2 tunnissa. Tätä seuraa c-myc m RNA:n kohoaminen, joka saavuttaa huippunsa 2 tunnin kohdalla ja laskee perustasolle 4 tunnin kohdalla. (Fausto N et ai. 1989; Morello D, 1989) Lisätutkimuksessa Morello D et al (1990) havaitsivat, että c-myc RNA:n lisääntyminen hepatektomian jälkeen on monta kertaa suurempi kuin valeleikkauksen jälkeen.

Edellä mainittujen tekijöiden lisäksi useat solut, kuten ovaalisolu, makrofagit, verihiutaleet ja kantasolut (CD133+), osallistuvat myös PHLR:ään suoraan tai epäsuorasti. (Evarts) RP et al 1987, Nakamura T et al 1986, Fausto N 2004, Xiang S et al 2012) AmEsch JS:n (2012) tutkimuksessa CD 133+ -kantasolujen infuusio paransi maksareserviä ja kokonaistulosta laajennetun hepatektomian jälkeen. T-solut voivat myös vaikuttaa maksan uusiutumiseen, ja hiirillä, joilla on T-solu- ja lymfotoksiinipuutos, on heikentynyt maksan uusiutumiskyky. (Anders SA et al 2005, Tumanov AV et al 2009) Ovaalit solut ovat vähemmän herkkiä TGF-beetan estoon, mikä voi merkittävästi estää proliferaatiota kypsiä hepatosyyttejä, joten nämä solut (ovaalit solut) tarjoavat vaihtoehtoisen reitin maksan regeneraatiolle. (Lenanh NN et al 2007) TGF beeta estää hallitsemattoman heptosyyttien lisääntymisen ja TGF beeta m RNA:n ilmentyminen saavuttaa huippunsa kohti solunjakautumisen ja mitoosin päättymistä, ja sillä on myös estävä vaikutus EGF:n aktiivisuuteen. (Nquyen LN et ai. 2007, Braun L et ai., 1988, Fausto N et ai. 1990). Romero GJ:n ja (2005) tekemässä tutkimuksessa TGF-beeta-reseptorin knockout-hiirillä, joille oli poistettu heptektomoitu, lisääntyi maksasolujen lisääntyminen ja maksan massan suhde kehoon.

Scotte M et al (1997) tutkivat sytokiinien ilmentymistä maksassa pienen ja suuren hepatektomian jälkeen rotilla ja havaitsivat, että TNF ja IL-1 lisääntyvät pienen ja suuren hepatektomian jälkeen, kun taas IL-6:n noususäätely on näkyvämpää suuren (80 %) hepatektomian jälkeen. Li J et al (2009) vertailivat regeneraatioprofiilia suuren (2/3) ja vähäisen (1/3) hepatektomian jälkeen rotilla, geeniekspressioprofiilit 4, 12 ja 30 tunnin kohdalla hepatektomian jälkeen osoittivat samanlaista ylös- ja alassäätöä, vaikka jotkut geenit osoitti ensisijaista ilmentymistä suuren hepatektomian jälkeen. Masson S et al (1999) tutkivat myös resektion laajuuden vaikutusta maksan regeneraatioon rotilla ja päättelivät, että regeneratiivista vastetta tapahtuu hepatektomian laajuudesta riippumatta, mutta regeneraation kulku ja kasvutekijöiden ilmentyminen vaihtelevat resektoidun maksan tilavuuden mukaan. M Nagino et al (2011) havaitsivat, että maksa uusiutuu nopeasti kahden ensimmäisen viikon aikana suuren hepatektomian jälkeen ja sen jälkeen se etenee hitaasti ja pysähtyy saavuttaessaan 3/4 alkuperäisestä maksan tilavuudesta, mikä tapahtuu yleensä 6 kuukauden - 1 vuoden kuluttua maksan poistosta. He havaitsivat myös, että sellaiset tekijät kuin resektion laajuus, kehon pinta-ala, porttilaskimon resektio, porttilaskimon emobilisaatio ja ICG-puhdistuma liittyvät maksan tilavuuden uusiutumiseen hepatektomian jälkeen.