Studie van bemiddelaars van leverregeneratie na hepatectomie

Prospectief niet-gerandomiseerd onderzoek om de expressie van mediatoren van leverregeneratie na hepatectomie (PHLR) te bestuderen en te vergelijken met een niet-hepatectomiegroep: een pilootstudie

Achtergrond: Experimentele studies met diermodellen na hepatectomie zijn gebruikt om het mechanisme van leverregeneratie te bestuderen. Hepatectomie voor verschillende ziekten en levertransplantatie met een levende donor bieden een goed menselijk model om het in vivo mechanisme van leverregeneratie te bestuderen. Deze studies zijn nodig voor de klinische toepassing van de kennis verkregen door dierexperimenten en zullen als leidraad dienen voor verder onderzoek om nieuwe modaliteiten te ontwikkelen voor de behandeling van leverfalen, cirrose en kanker.

Inleiding:

Lever is een vitaal orgaan dat verschillende metabole en beschermende functies vervult die nodig zijn voor het behoud van het leven en het heeft een inherent vermogen om te regenereren en het volume te herstellen na gedeeltelijke resectie. Leverregeneratie na hepatectomie vindt voornamelijk plaats door proliferatie van rijpe hepatocyten (Fausto N 2003 & 2004); veranderingen in portale hemodynamiek en cytokines (IL-6, TNF-α) worden beschouwd als de belangrijkste triggerfactoren voor dit proces. (Abhshagen K et al 2012, Scotte M et al 1997) Er wordt voorgesteld dat een verhoogde afgifte van portaalbloed aan de resterende lever schuifspanningsletsel veroorzaakt, wat leidt tot het vrijkomen van factoren zoals NO en VEGF die de regeneratiecascade activeren (Marabushi et al 2004). Cytokinen (IL-6 en TNF-α), NO en VEGF werken op pro HGF (inactieve hepatocytgroeifactor) om het om te zetten in actieve HGF die werken via Met-receptoren om STAT-3 verder te activeren, wat een belangrijke bemiddelaar is in de vroege fase van PHLR. (Abhshgen K et al 2008, Cresman DE et al 1996, Cressman DE 1997, Sudo K et al 2008, Borowicak M et al 2004, Paranjpe S et al 2007) Verhoogde afgifte van portaalbloed aan resterende lever verhoogt ook de beschikbaarheid van aminozuren per eenheid , pancreashormonen, uit de darm afkomstige endotoxinen en andere hepatotrofe factoren, al deze kunnen direct werken om DNA-replicatie te activeren. (Bucher NL et al 1977, Riehle KJ et al 2011) Toediening van een aminozuurmengsel aan intacte ratten induceert een golf van hepatocytenreplicatie en de deprivatie ervan blokkeert PHLR. (Mead JE et al 1990) Insuline, glucagon en groeihormoon hebben ook een significante invloed op leverregeneratie. (Bucher NLR 1976, Shi min luo et al 2004, Amal ZS et al 2011 ) Het vermogen van de lever om te regenereren na gedeeltelijke resectie stelt ons in staat hepatectomie uit te voeren voor levertransplantaties van levende donoren, leverneoplasmata en galkanker. Hepatectomie voor deze aandoeningen biedt ons ook een goed model om het in vivo mechanisme van leverregeneratie bij mensen te bestuderen. Deze studies zijn belangrijk voor de klinische toepassing van de kennis verkregen door experimentele studies bij dieren na hepatectomie. Deze studies zullen ons helpen de mediatoren van verschillende fasen van post-hepatectomie leverregeneratie (PHLR) te leren kennen en zullen toekomstig onderzoek begeleiden om nieuwe benaderingen te ontwikkelen voor de preventie en behandeling van levensbedreigende post-hepatectomie-complicaties zoals "Small for size syndrome", leverfalen . Deze sporen zullen helpen om de in vivo controle van cellulaire proliferatie te begrijpen en kunnen van vitaal belang blijken te zijn voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen voor de behandeling van cirrose en kanker.

Nulhypothese: expressie van mediatoren van leverregeneratie na hepatectomie (PHLR) is niet verschillend tussen hepatectomie (studiegroep) en niet-hepatectomiegroep (controlegroep).

Doel: Het mechanisme van leverregeneratie na hepatectomie (PHLR) bestuderen en expressie van mediatoren van PHLR vergelijken tussen hepatectomie (studiegroep) en een niet-hepatectomiegroep (controlegroep).

Doelstellingen :

1. De bemiddelaars van PHLR in menselijk model bestuderen.
2. Om de expressie van mediatoren PHLR te vergelijken tussen hepatectomie (studiegroep) en niet-hepatectomie (controlegroep).
3. Initiële veranderingen van PHLR in leverweefsel bestuderen. Patiënt en methode: dit prospectieve, niet-gerandomiseerde onderzoek zal worden uitgevoerd bij twee groepen patiënten: hepatectomie (studiegroep) en niet-hepatectomiegroep (controlegroep). In elke groep zullen minimaal 10 opeenvolgende volwassen (18 jaar of ouder) patiënten worden gerekruteerd. volgens onderstaande in- en uitsluitingscriteria. Geïnformeerde toestemming zal worden verkregen van de patiënten in beide groepen. Perifeer (uit een ader in de onderarm) veneus bloed (6 ml) wordt een dag voor de operatie afgenomen en na de operatie op dag 1, 3, 7, 14 (2 weken), 42 (6 weken) en 180 (6 weken) na de operatie. maanden). Een kleine tak van de poortader wordt gecanuleerd, een 20 gauge intraveneuze katheter voor het meten van de poortaderdruk en het opvangen van poortaderbloed (6 ml) aan het begin van de operatie maar na het binnendringen in de buik en aan het einde van de operatie maar daarvoor sluiting van de buik. Afname van het bloedmonster uit een perifere ader (onderarmader), meting van portale druk en afname van portale bloed zal worden gedaan in beide onderzoeksgroepen, maar patiënten in de hepatectomie (onderzoeks) groep zullen een aanvullende procedure ondergaan, d.w.z. trucut (naald) biopsie van de overgebleven lever.

Leverbiopsiemonsters worden bewaard in formaline-oplossing en overgebracht naar het pathologielaboratorium om initiële veranderingen tijdens PHLR en hun mogelijke mediatoren te detecteren, normaal leverweefsel aanwezig in gereseceerd monster zal dienen als zelfcontrole. Bloed uit de perifere ader en kleine takken van de poortader wordt verzameld in een standaardflesje dat voor dit doel wordt gebruikt en wordt overgebracht naar het laboratorium voor analyse om mediatoren van de leverregeneratie te detecteren. De analyse van het bloedmonster wordt uitgevoerd met behulp van de ELICHA-methode. Meting van de poortdruk zal worden gedaan door canulatie van een kleine tak van de poortader (bijv. Gastro-epiploïsche ader) na de ingang in de ader wordt deze intraveneuze katheter via een verbindingsslang gevuld met normale zoutoplossing aangesloten op een digitale drukrecorder. Deze digitale drukrecorder is beschikbaar in elk van de anesthesiewerkstations (merk: Drager) en geeft meestal metingen in mm Hg, de drukregistratie wordt voor en na de operatie gedaan om het effect van de operatie op de portaaldruk te observeren.

Inclusiecriteria: volwassen patiënten (18 jaar of ouder) met maligne neoplasmata van het maagdarmkanaal waarvoor ofwel een gedeeltelijke resectie van de lever (onderzoeksgroep) of resectie van andere delen van het maagdarmkanaal (controlegroep) nodig is en die bereid zijn deel te nemen aan het onderzoek.

Uitsluitingscriteria- Patiënten die niet bereid zijn deel te nemen aan het onderzoek. Patiënten met aandoeningen die de expressie van de mediator van PHLR kunnen beïnvloeden (bijv. immunosuppressie, chronische hepatitis, cirrose, portale hypertensie, zwangerschap, gebruik van anticonceptie), patiënten die tijdens de operatie een vergevorderde of inoperabele ziekte blijken te hebben, worden uitgesloten van het onderzoek en de van hen verzamelde gegevens worden niet opgenomen in de analyse.

Steekproefomvang: Minimaal 10 patiënten in elke groep Opzet: prospectief niet-gerandomiseerd onderzoek Plaats van het onderzoek: Afdeling gastro-intestinale chirurgie, GBPH en MAMC, New Delhi Duur: 2 jaar. Follow-up: 6 maanden Financiering: De onderzoekers zullen financiering aanvragen bij de overheidsinstanties. Mediator van PHLR te analyseren in perifeer bloed door middel van ELISA-methode - IL-1 IL-6, T N F-α, TNF-β, HGF (hepatocytgroeifactor), GH (groeihormoon), insuline en glucagon.

Onderzoek van leverbiopsiespecimen (immunohistochemie): mitotische index (Ki 67), EPCAM, STAT-3, receptor voor HGF, VEGF, NKAM en CD133.

Statistische methoden: Alle gegevens worden ingevoerd in Microsoft Excel en statistische berekeningen worden uitgevoerd met behulp van SPSS-software. Om de middelen voor de expressie van verschillende weefselfactoren in leverweefsel voor en na hepatectomie te vergelijken, gebruiken de onderzoekers de gepaarde t-test als de verdeling van de variabelen normaal is en de Wilcox-on-tekenrangtest voor een niet-normale verdeling. Voor het vergelijken van de expressie van mediatoren van leverregeneratie in serum van patiënten in studie- en controlegroepen zullen de onderzoekers de onafhankelijke t-test gebruiken voor een normale verdeling en de Mann Whitney-test voor een niet-normale verdeling. Om de gemiddelden van de serumspiegels van leverregeneratiemediatoren op verschillende tijdstippen voor en na de operatie te bestuderen, gebruiken de onderzoekers ANOVA voor een normale verdeling en de Friedman-test voor een niet-normale verdeling, gevolgd door een post hoc-test. P-waarde van 0,5 of lager zal worden gebruikt om significantie af te leiden.

Boekbeoordeling:

Leverregeneratie na hepatectomie is een zeer complex en ordelijk proces waarbij proliferatie van rijpe hepatocyten betrokken is om het levervolume te herwinnen. verandering in portale hemodynamiek, cytokines, groeifactor (HGF, TGF, EGF), hormonen (zoals GH, insuline of adrenaline) zijn actief betrokken bij dit proces dat wordt gecontroleerd door honderden genen. (Fausto N 2012 en Michelopoulos 2010) Marabushi et al (2004) stelden voor dat een acute toename van de hoeveelheid portale bloedtoevoer naar de resterende lever een schuifspanningsverwonding veroorzaakt die leidt tot de productie van stikstofmonoxide (NO), activering van calciumkanaal en afgifte van VEGF; ze spelen allemaal een sleutelrol bij het initiëren van het regeneratieproces. Bucher NL (1964) merkte op dat hemodynamische veranderingen in de portale bloedstroom direct gerelateerd zijn aan de mate van hepatectomie, toename in portale druk na 90% hepatectomie is veel hoger dan na 70% hepatectomie. Sato et al (1997&1999) herbevestigden de bevindingen van Bucher NL en zagen ook een progressieve toename van de poortdruk naarmate de regeneratie van de lever vordert en de afname daarvan naar voltooiing toe. Experimentele studies door verschillende onderzoekers zoals Wang en Lautt (1998), Cantre D et al (2008), Schoen JM et al (2001) en Mei Y et al (2011) bevestigden verder de rol van NO bij de activering van factoren die verantwoordelijk zijn voor de proliferatie van hepatocyten. VEGF dat vrijkomt uit sinusoïdaal endotheel is een reactie op schuifspanningsletsel en stimuleert HGF (hepatocytgroeifactor) om in te werken op c-met-receptoren en de proliferatie van hepatocyten te initiëren. (Paranjpe S et al. 2007, Borowiak M et al. 2004) Portale hypertensie geassocieerd met cirrose leidt niet tot schade door schuifspanning als gevolg van capillarisatie van sinusoïdale endotheelcellen (SEC's) en verlies van zeefplaten. (Sato et al. 1997 & Vollmer et al. 1998).

Suenaga M (1983) bestudeerde de rol van portaalbloed bij leverregeneratie na gedeeltelijke hepatectomie bij honden en merkte op dat voldoende portaalbloed nodig is voor hepatische regeneratie en dat een hoge concentratie aminozuren in het portaalbloed een positieve invloed heeft op het regeneratieproces. In een ander onderzoek merkten Skov OP et al (1988) op dat portaalbloed een grote hoeveelheid EGF (epidermale groeifactor), alvleesklierhormonen (insuline, glucagon) en andere groeifactoren bevat die actief deelnemen aan leverregeneratie. Bucher NL (1976 en 1977) merkte op dat insuline en glucagon beide leverregeneratie en DNA-synthese na hepatectomie vergemakkelijken, maar dat hiervoor een niet-portaalfactor vereist is, aangezien ze beide geen hepatocytenproliferatie in een intacte lever konden induceren, maar ze kunnen wel hepatocytenproliferatie induceren. bij hepatectomie en van de ingewanden ontdane ratten. Naast deze twee (insuline en glucagon) nemen ook andere hormonen zoals groeihormoon, nor-adrenaline, serotonine enz. deel aan dit proces. (Amal ZS et al, 2011; Shi Min Luo, 2004) IL-6 en TNF-α zijn twee factoren die essentieel zijn voor de initiatie van PHLR, portaalbloed bevat darmafgeleide factoren zoals lipopolysacchariden, complementfactoren en intercellulaire adhesiemoleculen die activeer Kupffer-cellen om IL-6 en TNF-α vrij te maken die op paracriene wijze werken om regeneratie te initiëren. (Fausto N 2006, Michelopoulos 2007, Cressman DE et al 1996, Feingold KR et al 1988, Sudo K et al 2008, Yamada Y et al 1997, Cornell RP et al 1985). Il-6, TNF-α, VEGF, NO initiëren regeneratie door HGF (hepatocytgroeifactor) te activeren, een krachtig hepatocytmitogeen. (Diaz JJ et al. 2011, Cantre D et al. 2008, Rai RM et al. 2005). HGF regelt samen met epidermale groeifactor (EGF), fibroblastgroeifactor (FGF), transformerende groeifactor (TGF), hepatotrofe hormonen en verschillende andere bekende en onbekende factoren de proliferatie en voortplanting van hepatocyten. (Fausto N 1993, Fausto N en Mead JE 1989). HGF bindt Met-receptor aan hepatocyten en activeert hun groei en proliferatie. (Borowick et al 2004) HGF, EGF en TGF alfa zijn krachtige in vitro mitogenen aangezien ze de proliferatie van hepatocyten in een normale lever kunnen induceren, zelfs in afwezigheid van andere factoren en in aanwezigheid van factoren zoals cytokines kunnen ze de proliferatie van een aanzienlijk deel van de hepatocyten stimuleren. (Block GD et al. 1996, Webber EM et al. 1998) TGF-a kan DNA-synthese en c-myc-expressie induceren wanneer het wordt toegevoegd aan rattenhepatocytenkweek. (Skouteris GG en Menamin MM 1992) Ontstekingsmediatoren zoals Prostaglandine (PGE-2) spelen ook een rol bij leverregeneratie aangezien het niveau ervan toeneemt na hepatectomie bij ratten, en dit proces is afhankelijk van c-AMP; toevoeging van prostaglandinen aan hepatocytkweek bleek de DNA-synthese te verhogen. (Tsujii H et al, 1993) EGF kan neonatale rattenhepatocyten in de primaire cultuur stimuleren om de S- en M-fasen binnen te gaan, die al na 4 uur kunnen worden gedetecteerd en pieken tussen 12 en 16 uur daarna neemt het af en dit effect kan worden gemoduleerd door serumfactoren en toediening van glucagon en insuline versterkt de groei verder. (Draghi E et al, 1980) HGF speelt een aanzienlijke rol in PHLR, na binding met receptor activeert het STAT-3 (signaaltransducer en activator van transcriptie 3) die de inductie van vroege responsgenen mediëren en Met-mutante muizen hebben verminderde leverregeneratie aangetoond .( Borowiak M et al 2004) Huh CG et al toonden in 2004 door hun studie op Met-mutante muizen aan dat de HGF/C-Met-signaalroute een centrale rol speelt bij ontwikkeling, leverregeneratie en tumorigenese. De HGF/Met-route reguleert de expressie van veel genen die verband houden met de celcyclus en apoptose, waaronder p53, cycline E en cycline B, om de celcyclus te bevorderen en apoptose te remmen in de 24 uur na gedeeltelijke hepatectomie. (Paranjpe S et al 2007) STAT-3 (signaaltransducer en activator-3) is een transcriptiefactor die verschillende primaire groeiresponsgenen reguleert na hepatectomie en kan worden geactiveerd door verschillende groeifactoren en cytokines.(Li W et al 2002) STAT-3 DNA-bindingsactiviteit neemt toe in overgebleven lever binnen 30 minuten na PH (partiële hepatectomie) en piekt tot 30-voudig binnen 3 uur en deze toename treedt niet op na schijnoperatie. (Cressman DE et al, 1995) Verschillende proto-oncogenen zijn ook betrokken bij het initiëren en voltooien van leverregeneratie, van deze c-fos zijn c-jun en c-myc belangrijke genen. C-fos- en c-jun-transcriptniveaus nemen bijna onmiddellijk na hepatectomie in de lever toe en keren na 2 uur terug naar normaal. Dit wordt gevolgd door verhoging van het c-myc m RNA dat na 2 uur zijn hoogtepunt bereikt en na 4 uur daalt tot het basale niveau. (Fausto N et al. 1989; Morello D., 1989) In een verdere studie ontdekten Morello D. et al. (1990) dat de toename van c-myc-RNA na hepatectomie vele malen hoger is dan die na schijnoperatie.

Naast de bovengenoemde factoren nemen verschillende cellen zoals ovale cellen, macrofagen, bloedplaatjes en stamcellen (CD133+) ook direct of indirect deel aan PHLR. (Evarts RP et al 1987, Nakamura T et al 1986, Fausto N 2004, Xiang S et al 2012) In een studie van amEsch JS (2012) verbeterde de infusie van CD 133+ stamcellen de leverreserve en het algehele resultaat na langdurige hepatectomie. T-cellen kunnen ook de leverregeneratie beïnvloeden en muizen met een tekort aan T-cellen en lymfotoxine hebben een verminderd vermogen tot leverregeneratie. (Anders SA et al 2005, Tumanov AV et al 2009) Ovale cellen zijn minder gevoelig voor remming door TGF-bèta, wat de proliferatie van rijpe hepatocyten significant kan remmen, dus deze cellen (ovale cellen) bieden een alternatieve route voor leverregeneratie. (Lenanh NN et al 2007) TGF beta is een remmer van ongecontroleerde heaptocytenproliferatie en TGF beta m RNA-expressie bereikt een hoogtepunt in de richting van de voltooiing van celdeling en mitose. Het heeft ook een remmend effect op EGF-activiteit. (Nquyen LN et al. 2007, Braun L et al., 1988, Fausto N et al. 1990). In een studie van Romero GJ et (2005) vertoonden TGF-bèta-receptor-knock-out muizen met heptectomie een verhoogde proliferatie van hepatocyten en een verhoogde verhouding tussen levermassa en lichaam.

Scotte M et al (1997) bestudeerden de cytokine-expressie in de lever na kleine en grote hepatectomie bij ratten en ontdekten dat TNF en IL-1 toenemen na kleine en grote hepatectomie, terwijl IL-6-regulatie prominenter aanwezig is na grote (80%) hepatectomie. Li J et al (2009) vergeleken het regeneratieprofiel na grote (2/3e) en kleine (1/3e) hepatectomie bij ratten, genexpressieprofielen op 4, 12 en 30 uur na hepatectomie vertoonden vergelijkbare opwaartse en neerwaartse regulatie hoewel sommige genen vertoonde preferentiële expressie na majeure hepatectomie. Masson S et al (1999) bestudeerden ook de invloed van de mate van resectie op leverregeneratie bij ratten en concludeerden dat regeneratieve respons optreedt ongeacht de mate van hepatectomie, maar het verloop van regeneratie en expressie van groeifactoren verschilt afhankelijk van het volume van de gereseceerde lever. M Nagino et al (2011) merkten op dat de lever snel regenereert in de eerste twee weken na een grote hepatectomie en daarna langzaam vordert en stopt wanneer het 3/4e van het oorspronkelijke levervolume bereikt, wat meestal 6 maanden tot 1 jaar na de hepatectomie plaatsvindt. Ze merkten ook op dat factoren zoals resectie, lichaamsoppervlak, resectie van de poortader, emobilisatie van de poortader en ICG-klaring geassocieerd zijn met het regenereren van het levervolume na de hepatectomie.